中藥單體對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用及其線(xiàn)粒體機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞是肝內(nèi)數(shù)量最多，體積最大的細(xì)胞群，約占肝臟細(xì)胞總量的80％。當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，會(huì)釋放出一系列的細(xì)胞因子，激活肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)，促使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常增生，導(dǎo)致肝纖維化（Hepatic fibrosis）形成。肝細(xì)胞損傷在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中起著非常重要的作用，尤其是肝細(xì)胞凋亡。尋找肝細(xì)胞保護(hù)藥物將成為肝纖維化治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)活

2、性氧(Reactive oxygen species，ROS)主要來(lái)源地，也是ROS氧化損傷的。因此尋找天然抗氧化物如中藥或中藥單體，清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS，維持線(xiàn)粒體正常功能形態(tài)來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞，是開(kāi)啟肝纖維化藥物治療的新途徑。
　　冬蟲(chóng)夏草又名蟲(chóng)草(Cordyceps sinensis)是一種名貴的藥用真菌，具有抗炎癥，抗癌癥，抗衰老，增強(qiáng)免疫功能和調(diào)節(jié)生死等功能。越來(lái)越多研究表明在各種氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷過(guò)程中，蟲(chóng)草起到一定的

3、抗氧化作用，保護(hù)線(xiàn)粒體。由于蟲(chóng)草包含很多有效成分如蟲(chóng)草多糖，蟲(chóng)草素，蟲(chóng)草酸，生物堿，脂肪和脂肪酸等，具體哪種有效成分起抗氧化作用還尚不清楚。本研究主要從蟲(chóng)草中選取蟲(chóng)草多糖(Cordyceps polysaccharide，CPS)，蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸三種有效成分，研究它們對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)篩選出最佳藥物濃度，hoechst33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測(cè)了線(xiàn)粒體ROS，線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrialmembr

4、ane potential，MMP)，能量(Adenosine Triphosphate，ATP)合成，細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyto C)釋放，免疫跡印實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CPS抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)地肝細(xì)胞活性下降，抑制肝細(xì)胞凋亡，并且消除細(xì)胞內(nèi)多余的ROS，維持MMP穩(wěn)定，保證ATP正常合成，阻止Cyto C釋放，并且下降Bax/Bcl-2比率，這些研究都表明蟲(chóng)草多糖發(fā)揮抗氧化活性保護(hù)線(xiàn)粒體不

5、受損傷。蟲(chóng)草素不能阻止過(guò)氧化氫誘導(dǎo)地肝細(xì)胞活力下降，和蟲(chóng)草酸可以抑制細(xì)胞活力下降，蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸對(duì)線(xiàn)粒體各項(xiàng)指標(biāo)的保護(hù)作用都不是很顯著。
　　丹參(Salvia miltiorrhiza)是一種藥用價(jià)值非常高的傳統(tǒng)中藥(TraditionalChinese Medicine, TCM)，被廣泛地用于治療各種疾病如腦血管疾病、心血管疾病、心衰、肝硬化、肝纖維化等。大量研究表明丹參、丹參復(fù)方制劑及丹參有效成分在慢性肝病尤其是肝纖維化治

6、療起著非常重要，主要作用機(jī)制是丹參具有抗氧化活力，消除自由基，保護(hù)生物膜。以前研究發(fā)現(xiàn)丹參藥理成分包括脂溶性成分和水溶性成分，丹參水溶性成分藥理活性最顯著，尤其是以丹參素為基本結(jié)構(gòu)的酚酸類(lèi)化合物抗氧化活性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)丹參酚酸類(lèi)化合物丹酚酸B(Salvia miltiorrhiza B,SalB)、原兒茶醛和丹參素鈉進(jìn)行線(xiàn)粒體保護(hù)研究。本部分采用的實(shí)驗(yàn)方法與蟲(chóng)草有效成分對(duì)線(xiàn)粒體保護(hù)作用研究相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SalB抵制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)地

7、細(xì)胞活性下降，阻止細(xì)胞凋亡，消除細(xì)胞內(nèi)多余的ROS，阻止MMP崩解，維持ATP正常合成，阻止Cyto C釋放，降低Bax/Bcl-2比值，抑制pro-caspase3的活化成cleave-caspase3，這些研究表明SalB發(fā)揮抗氧化作用，抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)地線(xiàn)粒體凋亡，從而保護(hù)肝細(xì)胞。原兒茶醛和丹參素鈉不能抑制細(xì)胞活力下降，但能消除細(xì)胞內(nèi)多余ROS，對(duì)線(xiàn)粒體其他指標(biāo)保護(hù)作用不能明顯。
　　在正常細(xì)胞內(nèi)，線(xiàn)粒體相互連接形成管網(wǎng)狀結(jié)

8、構(gòu)，并發(fā)生著頻繁地融合與分裂。線(xiàn)粒體融合與分裂是由一系列蛋白介導(dǎo)的，二者之間的動(dòng)態(tài)平衡維持著線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能。當(dāng)細(xì)胞受氧化應(yīng)激刺激后，融合與分裂失衡，線(xiàn)粒體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)碎裂，形成點(diǎn)泡狀。Mortalin是HSP70家庭成員之一，主要定位于線(xiàn)粒體，參與應(yīng)激反應(yīng)、胞內(nèi)運(yùn)輸、線(xiàn)粒體蛋白輸入、調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)。我們實(shí)驗(yàn)室以前研究發(fā)現(xiàn)mortalin高表達(dá)能夠清除細(xì)胞內(nèi)多余的ROS，維持線(xiàn)粒體膜電位穩(wěn)定和ATP正常合成，

9、阻止Cyto C釋放，抑制Bax構(gòu)象改變，抑制缺糖誘導(dǎo)地PC12細(xì)胞凋亡。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SalB具有抗氧化作用，保護(hù)線(xiàn)粒體正常功能。但是mortalin和SalB是否通過(guò)維持線(xiàn)粒體融合與分裂之間地平衡來(lái)保護(hù)線(xiàn)粒體以及mortalin和SalB是否存在某種聯(lián)系，這些機(jī)制都尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用MTG標(biāo)記線(xiàn)粒體，構(gòu)建mortalin高表達(dá)與低表達(dá)質(zhì)料，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體融合分裂相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平，免疫印跡檢測(cè)了線(xiàn)粒體融合分裂

10、相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SalB和mortalin高表達(dá)抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)地線(xiàn)粒體片段化，mortalin低表達(dá)不影響線(xiàn)粒體形態(tài)，過(guò)氧化氫處理后加劇線(xiàn)粒體片段化，SalB能夠增加mortalin蛋白表達(dá)量。Mortalin高表達(dá)能夠提高M(jìn)fnl和Opa1 mRNA表達(dá)水平，對(duì)Mfn2 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響，降低Hfis1和MTP18 mRNA表達(dá)水平，提高Drp1 mRNA表達(dá)水平。SalB對(duì)Mfn2沒(méi)有直接作用，提高Hfi