性類(lèi)固醇激素對(duì)尼羅羅非魚(yú)雌雄生長(zhǎng)差異與生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、因?yàn)榫哂猩L(zhǎng)快、食性雜和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，羅非魚(yú)已成為世界重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。其雌雄生長(zhǎng)差異明顯，雄性生長(zhǎng)快、個(gè)體大，而雌性生長(zhǎng)慢、個(gè)體??；性成熟前雄魚(yú)較雌魚(yú)生長(zhǎng)快，性成熟后更加明顯，部分原因可能性有：性類(lèi)固醇激素水平、生長(zhǎng)與生殖能量配置、攝食消化等差異。本論文以尼羅羅非魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先比較了性成熟前雌雄魚(yú)生長(zhǎng)特征與性類(lèi)固醇激素分泌水平關(guān)系；通過(guò)體外注射性類(lèi)固醇激素，分別研究了性類(lèi)固醇激素對(duì)生長(zhǎng)軸相關(guān)基因、生肌因子、攝食基因的表達(dá)調(diào)節(jié)影響；最

2、后比較了雌雄魚(yú)性類(lèi)固醇激素受體表達(dá)差異，旨在為羅非魚(yú)雌雄性別生長(zhǎng)差異的調(diào)節(jié)機(jī)理研究提供資料，主要結(jié)果如下：
　　（1）利用分子標(biāo)記法、醋酸洋紅壓片法、組織切片技術(shù)等方法進(jìn)行個(gè)體性別鑒定，比較了性成熟前期（0.5～4月齡）尼羅羅非魚(yú)雌、雄魚(yú)生長(zhǎng)差異，并檢測(cè)了2.5～4.0月齡雌、雄魚(yú)血清睪酮（T）、雌二醇（E2）激素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌、雄魚(yú)全長(zhǎng)、體重分別自3.0月齡、2.5月齡開(kāi)始出現(xiàn)差異顯著。Logistic擬合全長(zhǎng)、體重生長(zhǎng)方程

3、為： Lt(♀)=16.443/(1+e(2.821-1.363*t))， Lt(♂)=18.248/(1+e(2.752-1.295*t))；Wt(♀)=107.704/(1+e(5.157-1.464*t)，Wt(♂)=134.796/(1+e(5.080-1.417*t)，雌、雄魚(yú)全長(zhǎng)、體重的擬合度R2均大于0.94，擬合效果均較好。隨著月齡增加，雌、雄魚(yú)全長(zhǎng)、體重差異逐漸增大，全長(zhǎng)生長(zhǎng)速度最大時(shí)月齡為2.069和2.125，全長(zhǎng)

4、生長(zhǎng)曲線不具拐點(diǎn)，隨著月齡的增加，逐漸趨向漸進(jìn)值；體重的拐點(diǎn)月齡為3.523和3.585，拐點(diǎn)體重值為52.352g和67.398g，雄魚(yú)體重拐點(diǎn)月齡與拐點(diǎn)體重值均大于雌魚(yú)。對(duì)Logistic方程求一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)，分別得雌、雄魚(yú)生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)加速度。雌、雄魚(yú)的全長(zhǎng)、體重生長(zhǎng)速度均是先上升后下降，隨著生長(zhǎng)發(fā)育，雌、雄魚(yú)體重差異逐漸增大，體重生長(zhǎng)速度的差異也逐漸增大。雌、雄魚(yú)全長(zhǎng)、體重生長(zhǎng)加速度變化規(guī)律類(lèi)似，呈上升-下降-再上升趨勢(shì)。在

5、全長(zhǎng)生長(zhǎng)速度最大時(shí)，加速度為零，此后為負(fù)值，生長(zhǎng)速度減小。體重生長(zhǎng)加速度的最大值和最小值（兩個(gè)極值）分別對(duì)應(yīng)始速點(diǎn)和終速點(diǎn)，相應(yīng)分為三個(gè)時(shí)期：緩慢生長(zhǎng)期、快速生長(zhǎng)期和漸進(jìn)生長(zhǎng)期，雌魚(yú)進(jìn)入快速生長(zhǎng)期的始速點(diǎn)（2.623月齡）和終速點(diǎn)（4.422月齡）都比雄魚(yú)（2.655月齡，4.514月齡）提前，雄魚(yú)快速增長(zhǎng)期的凈增長(zhǎng)量（77.831g）和快速增長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)間（1.859月）大于雌魚(yú)（1.799g，60.525月），雄魚(yú)體重增加顯著大于雌魚(yú)

6、。2.5月齡之后，雌、雄魚(yú)E2含量差異顯著，3月齡之后，雌、雄魚(yú)T含量差異顯著，雄魚(yú)雄激素水平高、雌激素水平低，生長(zhǎng)更快；而雌魚(yú)雄激素水平相對(duì)低，雌激素水平高，生長(zhǎng)較慢，這可能與雌、雄魚(yú)在性腺發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行的生殖投入不同有關(guān)。推測(cè)E2、T含量差異是引起尼羅羅非魚(yú)雌雄性別生長(zhǎng)差異的原因之一。
　?。?）采用體外注射雌二醇、睪酮的方法結(jié)合熒光定量PCR方法，比較了E2和T對(duì)雌雄尼羅羅非魚(yú)的生長(zhǎng)、攝食、血清性類(lèi)固醇激素水平、肝臟 GH-

7、IGF生長(zhǎng)軸基因、肌肉生肌因子基因表達(dá)量的影響，結(jié)果表明：對(duì)照組雄魚(yú)較雌魚(yú) T水平更高，E2水平更低。E2注射后升高血清E2水平，T注射后升高血清T水平，對(duì)照組雌魚(yú)較雄魚(yú)生長(zhǎng)率較低，E2促進(jìn)雌魚(yú)生長(zhǎng)，對(duì)雄魚(yú)生長(zhǎng)影響不明顯，T顯著促進(jìn)雄魚(yú)生長(zhǎng)，對(duì)雌魚(yú)生長(zhǎng)影響不明顯；E2顯著促進(jìn)雌魚(yú)igf1, igf2, ghr1, ghr2表達(dá)；但不顯著影響雄魚(yú)igf1, igf2,一定程度降低ghr1, ghr2表達(dá)T對(duì)雄魚(yú)作用大于雌魚(yú)；顯著升高雄魚(yú)i

8、gf1, igf2, ghr1, ghr2表達(dá)；升高雌魚(yú)ghr1, ghr2表達(dá)，顯著降低igf2表達(dá)。E2顯著升高雌魚(yú)myod1, myf5表達(dá)量，T顯著升高雄魚(yú) myod1, myod2, myf5表達(dá)量，E2降低雄魚(yú)myog2, myf5表達(dá)量，不影響myod1表達(dá)量，T升高雌魚(yú)myog表達(dá)量，不顯著影響myod1, myod2表達(dá)量。性類(lèi)固醇激素對(duì)GH-IGF生長(zhǎng)軸、生肌因子相關(guān)基因表達(dá)有一定的作用，這種作用表現(xiàn)出明顯的雌雄差異

9、性，推測(cè)性雌雄類(lèi)固醇激素水平不同可能是導(dǎo)致雌雄個(gè)體生長(zhǎng)差異顯著的一個(gè)重要原因。
　?。?）攝食與消化水平是影響魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的重要環(huán)節(jié)。通過(guò)體外注射雌二醇（E2）、睪酮（T），測(cè)定注射后6h、12h、24h尼羅羅非魚(yú)雌雄魚(yú)消化酶（胃蛋白酶、腸淀粉酶、腸脂肪酶）活性，并采用熒光定量PCR方法，比較腦組織ghrelin、leptin、orexin、NPY、CCK mRNA表達(dá)量的差異。結(jié)果表明，注射后24h，T顯著提高雄魚(yú)淀粉酶活性；注射E

10、2和T后12h，對(duì)照組三種消化酶活性均升高，且此時(shí)對(duì)照組雄魚(yú)淀粉酶、脂肪酶活性較雌魚(yú)高。注射后6h、12h、24h，E2顯著升高雌魚(yú)ghrelin、NPY mRNA表達(dá)量，但不顯著影響雄魚(yú)，E2降低雌魚(yú)leptin mRNA表達(dá)量，6h時(shí)E2升高雄魚(yú)leptin mRNA表達(dá)量，12h、24h影響不明顯；注射T顯著升高雄魚(yú)ghrelin、NPY mRNA表達(dá)量，但不顯著影響雌魚(yú)，降低雄魚(yú)leptin mRNA表達(dá)量，6h、24h時(shí)T顯著

11、升高雌魚(yú)leptin mRNA表達(dá)量，12h時(shí)影響不明顯；24h時(shí)E2顯著升高雌魚(yú) orexin表達(dá)量，其他時(shí)間點(diǎn)影響不顯著，24h時(shí)T顯著升高雄魚(yú)orexin表達(dá)量，其他時(shí)間點(diǎn)影響不顯著；6h、12h、24h時(shí)E2顯著降低雌魚(yú)CCK mRNA表達(dá)量，T顯著降低雄魚(yú)表達(dá)量。結(jié)果表明，E2顯著升高雌魚(yú)、T顯著升高雄魚(yú)促攝食基因表達(dá)量降低抑制食欲基因表達(dá)量，對(duì)雌雄魚(yú)脂肪酶、蛋白酶影響不明顯，攝食基因可能參與了性類(lèi)固醇激素對(duì)雌雄尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)

12、的調(diào)節(jié)。
　　（4）采用Western-blot、免疫組化、熒光定量PCR的方法，對(duì)尼羅羅非魚(yú)雌雄魚(yú)肝臟、性腺、腸、腎臟進(jìn)行雌雄激素受體（ER、AR）基因、蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行了比較，Western-blot表明：性腺（精巢、卵巢）ER蛋白表達(dá)量最高，腸、腎臟中差異不明顯，雌雄魚(yú)肝臟中ER蛋白表達(dá)量差異明顯，卵巢和精巢ER蛋白表達(dá)量差異明顯；卵巢和精巢AR蛋白表達(dá)量差異明顯，雌雄魚(yú)腎臟AR蛋白表達(dá)量差異明顯，性腺（精巢、卵巢）AR蛋

13、白表達(dá)量最高。免疫組化結(jié)果表明：雌雄魚(yú)性腺、腸、腎中均檢測(cè)到了ER和AR免疫陽(yáng)性反應(yīng)，雌魚(yú)肝臟陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在中央靜脈附近，雌魚(yú)肝臟未發(fā)現(xiàn)AR陽(yáng)性反應(yīng)，雄魚(yú)肝臟未發(fā)現(xiàn)ER陽(yáng)性反應(yīng)；雄魚(yú)腸免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在腸絨毛和腸粘膜下層；雌魚(yú)腎ER較雄魚(yú)陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)，雄魚(yú)腎AR較雌魚(yú)陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要分布在腎小管中；卵巢ER陽(yáng)性細(xì)胞分布在濾泡膜周?chē)移銭R陽(yáng)性反應(yīng)較雄魚(yú)明顯，精巢AR陽(yáng)性細(xì)胞分布在精小管周?chē)?，且其AR陽(yáng)性反應(yīng)較雌魚(yú)