云甲斑蝥素靶向抑制PP2Ac抗腎間質纖維化的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　通過TGF-β1體外刺激人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）建立腎間質纖維化細胞模型，探討:(1) NCTD是否通過靶向抑制PP2Ac發(fā)揮抗腎間質纖維化作用;(2) NCTD抗腎間質纖維化是否與其抑制PP2Ac介導Smad3-L區(qū)去磷酸化有關。
　　方法：
　　1、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，分別通過過表達PP2Ac和小干擾RNA敲低PP2Ac表達后，應用TGF-β1(5ng/ml)刺激和NCTD(2.5μg/ml)

2、進行干預24h。采用RT-PCR和Western印跡法檢測PP2Ac、FN、Col-Ⅰ、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表達水平。
　　2、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，應用NCTD(2.5μg/ml)進行預干預24h和TGF-β1(5ng/ml)刺激1h。采用間接細胞免疫熒光法檢測pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細胞的分布，Western印跡法檢測總蛋白中PP2Ac和核蛋白中pSmad

3、3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)的表達。
　　結果：
　　1、TGF-β1刺激HK-2細胞24h致PP2Ac表達上調的同時，F(xiàn)N、Col-Ⅰ和α-SMA表達上調，E-cadherin表達下調，HK-2細胞纖維化加重;而轉染PP2Ac過表達質粒后再用TGF-β1刺激，則PP2Ac表達上調更為明顯，HK-2細胞纖維化加重更顯著;NCTD干預使PP2Ac表達下調，同時FN、Col-Ⅰ和α-SMA表達下調，E

4、-cadherin表達上調，HK-2細胞纖維化緩解;
　　2、小干擾RNA敲低PP2Ac表達后，F(xiàn)N、Col-Ⅰ和α-SMA表達下調，E-cadherin表達上調，HK-2細胞纖維化緩解;而NCTD與小干擾RNA共同抑制PP2Ac表達后，對HK-2細胞纖維化的緩解程度同單純PP2Ac小干擾RNA干預組比較無明顯差異;
　　3、免疫熒光結果顯示，空白對照組中pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)基本

5、無表達，TGF-β1刺激HK-2細胞1h后pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細胞核內表達明顯增多，NCTD干預使pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細胞核內表達進一步增多。Western印跡結果顯示，TGF-β1刺激1h使得PP2Ac蛋白表達上調的同時，細胞核內pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)蛋白表達均增多，NCTD干預使PP2Ac表達下