家蠶卵殼基因鑒定、功能及其表達調控研究.pdf

1、昆蟲種類繁多、數(shù)量巨大，是地球生物多樣性的重要貢獻者。在長期的進化過程中，昆蟲與人類形成了復雜而密切的關系。一方面，昆蟲為人類提供了大量的物質產品，其中鱗翅目昆蟲家蠶也創(chuàng)造了璀璨的蠶絲文化；另一方面，昆蟲也給人類造成了重大的經濟損失，其中直翅目昆蟲蝗蟲更是書寫了一部人類農業(yè)社會的血淚史。昆蟲數(shù)量多種類豐富的主要原因是驚人的產卵能力，大部分昆蟲的產卵量高達數(shù)百顆。因此，對昆蟲卵的研究將為有害昆蟲的防治，有益昆蟲產卵量的提高提供重要的理論基

2、礎。
　　卵殼是昆蟲卵細胞表面復雜的保護性結構，主要成分為卵殼蛋白，其編碼基因為卵殼基因。本研究以鱗翅目家蠶為研究對象，關注了卵殼基因的功能與調控。首先，鑒定了家蠶卵殼基因并繪制了其時期表達模式圖譜，利用LC-MS/MS，分析了卵殼的蛋白質組成；其次，在功能研究上，以卵殼基因突變體桂灰卵（Grk）為材料，分析了其可能的突變機理；最后，在表達調控上，以miRNA為研究切入點，重點分析了miRNA在卵殼基因表達調控中的角色。本研究獲得

3、的主要研究結果如下：
　　1.卵殼基因的鑒定及進化分析
　　家蠶卵殼基因是一個超基因家族，所有成員都位于2號染色體上的一段基因組區(qū)域內（卵殼基因位點）。卵殼基因經歷了近40年的研究，近百個卵殼基因被鑒定。然而，高度的重復序列使卵殼基因位點測序非常困難，至今未被完整測序，這嚴重阻礙了卵殼基因全面、系統(tǒng)的研究。為此，本研究采用了對BAC測序的策略獲得了卵殼基因位點全長序列。首先，分析了家蠶BAC文庫中卵殼基因位點上200多個BA

4、C的分布，篩選出7個能覆蓋完整卵殼基因位點的BAC。通過對7個BAC的測序，拼接組裝得到了871,711bp的卵殼基因位點序列，利用FGENESH軟件對卵殼基因位點序列進行基因預測，注釋到127個卵殼基因和5個非卵殼基因，其中卵殼基因標注為BmCho-1～BmCho-127，包括36個早期、46個中期和45個后期卵殼基因。兩個卵發(fā)育時期的cDNA文庫被用于進一步確認卵殼基因EST的存在，反向證實了注釋的卵殼基因。卵殼基因主要以基因對（g

5、ene pair）的形式分布在基因組上。兩個后期卵殼基因因編碼區(qū)有多個終止密碼子被成為假基因（pseudogene）。
　　進化樹分析結果顯示同類型的卵殼基因聚成一簇，其中早期B類卵殼基因（early B）在進化樹上分為兩個分支，其中一支和中期B類卵殼基因（middle B）聚到一個大的分支上。卵殼基因的表達模式顯示，這個早期B類卵殼基因分支中的7個基因有著中期卵殼基因相似的時期表達模式。進化樹分析也揭示早期卵殼基因經歷著較快的進

6、化速度，后期卵殼基因在進化上相對保守。兩個假基因BmCho-23和BmCho-26也經歷了較快的進化速度。
　　完整卵殼基因位點的鑒定是卵殼基因全面、系統(tǒng)研究的重要基礎，本部分后面的研究都是以此為基礎的。
　　2.卵殼基因的表達特征分析
　　為了分析卵殼基因在卵發(fā)育過程中的表達情況，我們構建了家蠶卵殼基因的精細表達模式圖。首先，我們對蛹8天不同發(fā)育時期的卵進行了時期分段，因卵黃生成期（vitellogenesis）無卵

7、殼基因表達，此時期的卵呈微黃色；卵殼生成期（choriogenesis）為卵殼基因次序表達的時期，此時因卵殼的形成使卵色發(fā)白發(fā)亮，這是卵黃與卵殼生成期分段的標志。根據(jù)卵殼基因表達的特征，將卵殼生成期細分為I～XI的11個發(fā)育時期。利用RT-PCR對鑒定的127個卵殼基因進行了時期表達模式圖譜的構建，結果顯示，早期和后期卵殼基因分別在卵殼生成期的早期（I～III）和后期（IX～XI）表達，而中期卵殼基因則在整個卵殼生成期皆有表達。

8、　　通過對家蠶cDNA庫搜索，鑒定到BmCho-1和BmCho-96在精巢中的轉錄本。卵泡上皮細胞和精巢中，BmCho-1的轉錄本有著相同的第二外顯子序列，第一外顯子則不同，BmCho-1的精巢轉錄本第一外顯子位于卵泡上皮細胞轉錄本的內含子區(qū)域。精巢中BmCho-96的轉錄本有三個外顯子，精巢和卵泡上皮細胞中轉錄本的編碼區(qū)序列相同，預測將編碼相同的蛋白質。在家蠶卵胚胎的cDNA文庫中，鑒定到BmCho-11的轉錄本，胚胎中的轉錄本編碼區(qū)

9、序列在5’端比卵泡上皮細胞中的轉錄本多27個堿基，預測多編碼9個氨基酸。
　　分析發(fā)現(xiàn)，幾乎每個后期卵殼基因除了成熟的轉錄本之外，還有一個拼接中間體形式（splicing intermediate），這種結構包含5’UTR、外顯子、內含子、3’UTR和多聚腺嘌呤序列。
　　3.卵殼結構的蛋白質組分析
　　通過LC-MS/MS質譜分析，在大造（P50）卵殼中鑒定到260個蛋白，包括88個卵殼蛋白、28個卵巢特異性蛋白（非

10、卵殼蛋白）和144個其它類型的蛋白。
　　家蠶卵殼基因主要以基因對（gene pair）的形式分布在基因組上，每個基因對包含一個A類和一個B類基因，兩個基因共用5’側翼的啟動子區(qū)域，A和B基因以相反的方向轉錄。在鑒定的卵殼蛋白中，基因對中B編碼的蛋白更容易被鑒定到，這暗示雙向啟動子對B基因可能有更強的轉錄活性。
　　卵殼中也鑒定到的一類卵巢特異的蛋白，編碼這類蛋白的基因主要成簇地分布在2號、10號、15號和16號染色體上，但

11、多數(shù)為功能未知的家蠶特異基因。在2號染色體的卵殼基因位點上游100 kb的范圍內分布著12個卵巢特異基因，其中的10個基因編碼的蛋白在卵殼中被鑒定到，雖然它們的功能未知，但推測它們在卵殼基因的表達或卵殼結構形態(tài)構建中扮演著重要的作用。
　　4.家蠶桂灰卵（Grk）突變機理初探
　　桂灰卵（Grk）是家蠶卵殼基因突變導致的灰色卵突變體，突變基因位于卵殼基因位點內（2-7.2）。表現(xiàn)型為：同質型（Grk/Grk）卵為球形，受精率

12、低；異質型（Grk/+）卵形正常，卵色為灰色，受精率正常；正常型（+/+）卵色為深褐色。
　　SEM觀察顯示，Grk三種基因型卵殼表面沒有明顯的差異，而它們的卵殼層和卵孔處有較大差異。在卵殼層上，Grk正常型的卵殼層由平行于卵細胞的片層構成；而雜合型卵殼中間層的片層呈現(xiàn)垂直于卵細胞表面的表型；純合型卵殼中間片層則出現(xiàn)了更大程度的破壞，幾乎呈現(xiàn)紊亂的狀態(tài)。在卵孔結構上，Grk正常型卵孔被花瓣狀斑紋圍繞，內層的斑紋凸出卵殼表面，卵孔出

13、有4個卵孔管口。雜合型卵孔周圍的花瓣狀斑紋明顯比正常型小，且內層的斑紋凸出程度減小，卵孔管口個數(shù)正常；純合型卵孔處的斑紋同樣變小，內層的斑紋幾乎無凸出的表型，卵孔管口僅為2個。Grk正常型、雜合型和純合型卵孔內層斑紋的花瓣數(shù)依次減少。通過對Grk卵殼的觀察，我們可以推斷Grk突變體在卵殼殼層結構發(fā)生的較大變化是導致其呈現(xiàn)灰色卵表型的基礎，卵孔管口的減少則是卵受精率大大降低的原因。
　　對卵殼結構蛋白提取時發(fā)現(xiàn)Grk正常型、雜合型及

14、純合型卵殼結構在8 M尿素/35mM DTT裂解液中溶解度依次降低，在此裂解液基礎上增加DTT濃度，將增加Grk突變體溶解度，但不能完全溶解。如果增加1%的SDS，則能完全溶解Grk突變體卵殼。這表明Grk突變體卵殼結構的變化可能影響了卵殼蛋白的溶解。
　　Grk三種基因型卵殼的定量蛋白質組學分析顯示，BmCho-20、BmCho-41、BmCho-57、BmCho-62、BmCho-73和BmCho-115在Grk正常型、雜合型

15、和純合型卵殼中的含量呈依次增加，其中BmCho-20和BmCho-115為早期卵殼蛋白，BmCho-73為中期卵殼蛋白，BmCho-41、BmCho-57和BmCho-62為后期卵殼蛋白。富含半胱氨酸的后期卵殼蛋白主要分布在卵殼外層，其豐富的二硫健使卵殼形成堅硬的外層結構，因此，3個后期卵殼蛋白的上調增加了Grk突變體卵殼的硬度，使其更難溶解。同時，卵殼基因具有嚴格的時期特異性，如果Grk通過延長表達時間來上調卵殼蛋白，則將會擾亂卵殼形

16、態(tài)構建的進程，造成卵殼結構的改變。另一方面，BmCho-17在正常型和雜合型卵殼中有表達，但在純合型中丟失，且BmCho-17是中期卵殼蛋白，應該在卵殼中層構建中起作用。因此它在Grk純合型卵殼中的丟失勢必影響到中層卵殼的形態(tài)構建。
　　5.miRNA對卵殼基因表達調控分析
　　卵殼基因表達有著嚴格的組織和時期特異性，其表達調控研究是最早的模式基因之一。但已報道的調控因子仍不能完全清楚地解釋數(shù)量龐大的卵殼基因的調控機制。為此

17、，本研究分析了miRNA在卵殼基因表達調控中的角色，通過高通量測序，在家蠶蛹8天卵殼生成期的卵泡上皮細胞中鑒定到847個miRNA，其中包括399個已知miRNA和448個新鑒定的miRNA。qPCR結果顯示，33個miRNA在卵泡上皮細胞特異表達。靶基因預測顯示miRNA潛在的調控了所有類型的卵殼基因及其轉錄因子，分析也發(fā)現(xiàn)，在miRNA對卵殼基因的調控中，存在著一個miRNA基于相同的靶位點序列調控一類卵殼基因的模式。miRNA與卵