RPA技術(shù)與微滴數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因玉米與大豆檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展與應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全管理至關(guān)重要。在這些檢測(cè)技術(shù)中，核酸在恒溫下的擴(kuò)增技術(shù)得到了較快的發(fā)展。與常規(guī)PCR相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不再需要熱循環(huán)儀器，可在恒溫條件下快速擴(kuò)增出目的片段，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。其中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase ploymerase amplification,RPA)，是核酸在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增的一種技術(shù)。微滴數(shù)字PCR(dropl

2、et digital PCR,ddPCR)，是一種核酸檢測(cè)與定量技術(shù)，也是最近幾年興起的新技術(shù)。本研究的內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、RPA結(jié)合凝膠檢測(cè)技術(shù)特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11：本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11外源基因草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,PAT)及載體骨架連接區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物，首次建立了基于 RPA與凝膠檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法，特異性地快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基

3、因玉米Bt11，在37℃條件下20min內(nèi)即可完成檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所得該方法的絕對(duì)檢測(cè)限約為100拷貝，相對(duì)檢測(cè)限約為0.1％。
　　2、RPA結(jié)合熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11外源基因 nos終止子：此研究選用轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11為材料，研究 RPA熒光技術(shù)檢測(cè)外源基因 nos終止子的靈敏度，測(cè)得絕對(duì)和相對(duì)檢測(cè)限分別約為50拷貝和0.1%。與之對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量 PCR染料法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11外源基因 nos終

4、止子，實(shí)驗(yàn)測(cè)得絕對(duì)檢測(cè)限達(dá)10拷貝甚至以下，相對(duì)檢測(cè)限為0.1%。熒光定量PCR可對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米含量進(jìn)行定量測(cè)定，但熒光定量PCR相對(duì)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要兩小時(shí)以上，并且定量時(shí)需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，過(guò)程復(fù)雜，而應(yīng)用RPA熒光技術(shù)檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，半小時(shí)就可以完成檢測(cè)。兩種技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)，可根據(jù)實(shí)際需要選取。
　　3、ddPCR測(cè)定轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2轉(zhuǎn)基因成分含量：在本研究中，使用了ddPCR和熒光定量PCR對(duì)10%的轉(zhuǎn)基因大豆GT

5、S-40-3-2標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因成分含量的測(cè)定，兩種方法測(cè)得轉(zhuǎn)基因含量與實(shí)際相符，都約為10%。相比ddPCR方法，熒光定量PCR需要更多的模板量和引物，加樣的數(shù)量也比較多。采用QX200TM Droplet Digital TM PCR系統(tǒng)，將兩套引物和探針加入到同一PCR管中，減少了加樣數(shù)量，也節(jié)省了模板量。在數(shù)據(jù)分析方面，熒光定量PCR方法需要根據(jù)熒光數(shù)值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)計(jì)算獲得基因的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因成分的含量，而ddPCR不