中國(guó)紅豆杉紫杉醇生物合成相關(guān)基因的克隆和異源表達(dá)研究.pdf

1、為了深入了解紫杉烷的生物合成途徑和探討基因工程技術(shù)應(yīng)用于紫杉醇生產(chǎn)的可能性,采用同源性為基礎(chǔ)的PCR方法首次從中國(guó)紅豆杉cDNA文庫(kù)克隆得到了一個(gè)新的中國(guó)紅豆杉紫杉烯醇?；D(zhuǎn)移酶cDNA序列.它長(zhǎng)為1,646 bp,編碼區(qū)為1,278 bp,推導(dǎo)編碼425個(gè)氨基酸(GenBank No:AY326950).根據(jù)NCBI-BLASTP比對(duì)GenBank序列數(shù)據(jù),我們可以推斷這個(gè)新克隆的cDNA序列編碼的?；D(zhuǎn)移酶與已鑒定的紅豆杉屬?；D(zhuǎn)移

2、酶屬同一亞家族.構(gòu)建了這個(gè)?；D(zhuǎn)移酶基因的pET系列原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)和非融合表達(dá),探討了兩種表達(dá)的差異,初步優(yōu)化了融合表達(dá)條件.采用鎳離子親和層析柱純化了融合蛋白trxA-TCA,并用多種紫杉烷底物和CoA底物對(duì)酶活性鑒定進(jìn)行了初步探索.本研究還采用PCR文庫(kù)篩選方法首次從中國(guó)紅豆杉cDNA文庫(kù)中克隆到一個(gè)羥基化酶cDNA片段.這個(gè)cDNA包含了一個(gè)1494bp的開放讀碼框架,編碼497個(gè)氨基酸殘基(GenBan

3、k No:AF545833).在使用DNAMAN和NCBI-BLASTP進(jìn)行比對(duì)后,推斷這個(gè)新克隆的TCH1 cDNA序列編碼紅豆杉紫杉烷10β-羥基化酶.本項(xiàng)研究采用了SSP-PCR方法從中國(guó)紅豆杉cDNA文庫(kù)中克隆羥基化酶基因.首次克隆得到一個(gè)新的中國(guó)紅豆杉羥基化酶TCH2 cDNA序列.測(cè)序表明TCH2cDNA全長(zhǎng)為1722bp,其中包含了一個(gè)完整的長(zhǎng)為1482bp的開放讀碼框架,推斷編碼493個(gè)氨基酸(GenBank No:AY

4、374652).序列比對(duì)分析這個(gè)新克隆的TCH2 cDNA序列編碼蛋白與其它已鑒定的紅豆杉屬羥基化酶在同一亞家族CYP725A.考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,結(jié)合植物對(duì)密碼子的偏好性,根據(jù)血紅素結(jié)合區(qū)保守氨基酸可以設(shè)計(jì)更多組的特異引物或簡(jiǎn)并引物進(jìn)行SSP-PCR反應(yīng),將可以克隆到更多的紅豆杉羥基化酶基因.本論文首次克隆了中國(guó)紅豆杉4個(gè)與紫杉醇或紫杉烷合成相關(guān)的羥基化酶與酰基轉(zhuǎn)移酶基因,2個(gè)基因?yàn)槭状螆?bào)導(dǎo),并對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行了異源表達(dá),為進(jìn)一步應(yīng)用