馬鏈球菌獸疫亞種類(lèi)M蛋白對(duì)細(xì)胞的粘附作用.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)對(duì)集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害嚴(yán)重，同時(shí)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。馬鏈球菌獸疫亞種的類(lèi)M蛋白是一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，且能夠抵抗抗體的吞噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬作用。本試驗(yàn)在分子水平上對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種類(lèi)M蛋白的粘附機(jī)制進(jìn)行了研究，為該菌的致病機(jī)制及引起的豬鏈球菌病的防控進(jìn)行了有益的探索。 根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌

2、獸疫亞種豬源ATCC35246株的類(lèi)M蛋白基因序列，設(shè)計(jì)和合成一對(duì)引物，并以ATCC35246株的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出去掉信號(hào)肽的類(lèi)M蛋白基因并定向克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)中。重組質(zhì)粒通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物約60kD，Western blot顯示，其與ATCC35246株多克隆抗血清反應(yīng)，抗原性良好。 以His親和層析拄純化

3、重組的類(lèi)M蛋白作為抗原免疫6～8周齡的BALB／c小鼠，三次免疫后，取脾細(xì)胞并與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的SP2／0細(xì)胞進(jìn)行融合，應(yīng)用滅活的ATCC35246菌液為包被抗原，建立間接EIASA篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)3次亞克隆之后得到12株穩(wěn)定分泌抗類(lèi)M蛋白單抗的細(xì)胞株，特異性檢測(cè)顯示其與豬鏈球菌2型等沒(méi)有交叉反應(yīng)。以BABL／c小鼠制備的腹水單抗，ELISA效價(jià)約為1:10000。 采用通用的模式細(xì)胞HEp-2細(xì)胞，研究馬鏈球菌獸疫亞種ATC

4、C35246株類(lèi)M蛋白的粘附作用。結(jié)果顯示，ATCC35246株可以粘附HEp-2細(xì)胞，它可以粘附細(xì)胞。用重組的類(lèi)M蛋白預(yù)處理HEp-2細(xì)胞，當(dāng)類(lèi)M蛋白的量達(dá)到160μg／500μL，可以完全抑制細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的粘附；用重組表達(dá)的類(lèi)M蛋白鼠單抗血清處理ATCC35246，可抑制其對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附，在1:200倍稀釋時(shí)即能完全抑制它對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附：而ATCC35246的全菌鼠抗血清在1:200時(shí)能完全抑制它對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附

5、。同時(shí)，以12株單抗處理細(xì)菌以后，發(fā)現(xiàn)單抗2C8具有明顯抑制細(xì)胞粘附的作用，說(shuō)明2C8對(duì)應(yīng)的抗原表位在細(xì)胞粘附中具有決定性作用。 以類(lèi)M蛋白的單抗細(xì)胞株2C8分泌的單抗作為靶分子，研究其對(duì)應(yīng)的抗原表位。用從前以試驗(yàn)得到的2C8單抗包被酶標(biāo)條孔，從12肽隨機(jī)肽庫(kù)中經(jīng)過(guò)5輪生物淘洗(結(jié)合、淘洗及富集)程序進(jìn)行篩選，第2輪以后降低2C8的包被濃度，同時(shí)升高洗液中吐溫-20的濃度。經(jīng)5輪親和篩選后，噬菌體的回收率從1.71×10<'-6

6、>增加到3.39×10<'-4>假陽(yáng)性率逐輪降低，由20.31％降至0.22％，表明陽(yáng)性克隆得到了有效富集。從第5輪篩選出的陽(yáng)性克隆中隨機(jī)挑取14個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)這些克隆采用ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA來(lái)鑒定其結(jié)合性和特異性，發(fā)現(xiàn)10個(gè)克隆有較強(qiáng)的結(jié)合力而不與其它單克隆抗體反應(yīng)。然后對(duì)這10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，所挑選的14個(gè)克隆均與單抗2C8有較強(qiáng)的結(jié)合性，其中10個(gè)克隆能夠發(fā)生較強(qiáng)抑制作用；從所測(cè)10個(gè)克隆的氨基酸序列分析，“S