小鼠TREM-1分子CDR1保守區(qū)的克隆、原核表達及純化.pdf

1、研究背景和目的： 膿毒癥具有較高的死亡率，嚴重危害人類健康。目前研究表明：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活單核/巨噬細胞引起的細胞因子過度釋放是臨床上膿毒癥的主要原因之一。LPS進入體內后主要是通過與脂多糖結合蛋白(LPS-bindingprotein，LBP)結合轉運到細胞膜上，與分泌型蛋白MD-2、膜上的CD14、TLR4(Toll-likereceptor4)等分子結合，形成結合有LPS的受體復合

2、體，由TLR4胞內段與MyD88結合啟動LPS信號轉導通路，最終引起NF-kB的活化，引起促炎癥細胞因子的釋放，使得炎癥反應放大。髓樣細胞表達的觸發(fā)受體-1(triggeringreceptorsexpressedonmyeloidcells-1,TREM-1)是新近發(fā)現的能放大炎癥反應的又一重要分子，對LPS等細菌產物引發(fā)的急性炎癥發(fā)應有顯著放大作用，該分子被認為可能是拮抗膿毒癥的重要靶分子之一。 TREM-1分子選擇性表達于

3、中性粒細胞、CD14+單核/巨噬細胞表面，分子表面有三個抗體等效互補決定區(qū)(antibody-equivalentcomplementaritydeterminingregion，CDR)。該分子在體內有兩種存在方式：膜結合型和可溶型，可溶型的TREM-1相當于膜結合型的胞外區(qū)。膜結合型TREM-1的活化需要LPS和位于血小板上的未知配體協(xié)同作用，活化后能顯著上調促炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、GM-CSF)和趨化因子

4、(IL-8、MCP-1)的持續(xù)分泌及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的釋放，引起中性粒細胞脫顆粒、呼吸暴發(fā)和吞噬反應，并抑制抗炎因子IL-10的表達；而可溶型TREM-1的功能則是抑制促炎癥細胞因子的產生，對敗血癥動物模型有保護作用。TREM-1分子的氨基酸的保守性分析發(fā)現CDR1附近的氨基酸序列也較為保守，而該區(qū)域的功能目前還無報道，該區(qū)域是否參加了TREM-1分子與LPS或天然配體的作用目前尚不明確。因此本研究

5、擬通過原核表達得到小鼠TREM-1CDR1保守區(qū)融合蛋白，并進行純化及相應的初步鑒定，為研究該區(qū)域的功能奠定基礎。 主要技術方法： 從正常成年昆明小鼠組織中提取細胞基因組DNA，利用PCR技術擴增出小鼠TREM-1分子CDR1保守區(qū)基因片段。構建好PET-30a(+)-CDR1原核表達載體，并轉化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中通過IPTG誘導表達。表達產物進行Tricine-SDS-PAGE電泳分析和Weste

6、rnblot檢測分析鑒定。超聲碎菌法對目的融合蛋白進行分離，并進行親和層析純化，最后經過透析復性獲得目的融合蛋白。 結果： 1.通過對小鼠TREM-1的同源性分析發(fā)現，CDR1附近較保守的氨基酸殘基主要位于羧基端的第31-56位，由DNAMAN軟件比對該區(qū)域的DNA和cDNA序列，發(fā)現其位于同一外顯子，故以小鼠基因組DNA為模板，確定擴增編碼18-63位的氨基酸的核苷酸序列。 2.采用PCR技術，以小鼠基因組DN

7、A為模板，擴增得到了編碼小鼠TREM-1含CDR1的保守區(qū)的長176bp的基因序列，其中含限制性酶切位點、原核終止密碼子等。 3.將該基因序列與原核表達載體pET30a(+)雙酶切后，連接產物轉化DH5α大腸桿菌，小量提取質粒，序列測定結果表明成功構建了pET-30a(+)-CDR1表達載體。 4.構建好的質粒成功轉化表達菌BL21(DE3)plysS，通過IPTG誘導陽性菌株進行表達，并優(yōu)化表達條件，確定了最適宜的表達

8、條件為30℃減慢誘導7h。電泳結果表明，重組陽性菌誘導后表達出約12kD大小的新生融合蛋白帶，與預期融合蛋白分子量相符。Westernblot鑒定結果顯示該蛋白與小鼠anti-His單克隆抗體有特異性結合能力。 5.應用Qiagen公司的Ni-NTAagarose，經pH梯度洗脫進行含6×His標簽融合蛋白的親和層析純化。經含GSH/GSSH的透析液透析復性，獲得小鼠TREM-1含CDR1的保守區(qū)融合蛋白。 結論：