抗精子適體的制備及其抑精功能的初步研究.pdf

1、目前我國市面上所售避孕用品雖然能有效降低非意愿妊娠率，但它們引起的副作用不容忽視。研發(fā)一種安全、有效降低非意愿妊娠率的避孕藥一直是計劃生育服務(wù)的熱點。適體是一類短序列單鏈核酸分子，通過折疊形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)而與靶分子有極高的特異性和親和力。適體分子因其合成簡單，分子尺寸小，易進(jìn)行修飾，靶分子范圍廣泛，易從血液中清除等優(yōu)勢，在基礎(chǔ)研究、疾病的診斷和治療領(lǐng)域里具有極大的應(yīng)用潛能。本研究以人精子細(xì)胞為靶標(biāo)細(xì)胞，通過改良指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技

2、術(shù)（cell-SELEX技術(shù)）篩選出能與人精子細(xì)胞特異性結(jié)合、有高親和力的適體分子群，通過毛細(xì)管精子運動能力檢測實驗評估所篩選的適體的抑精功能。
　　改良步驟包括連續(xù)強化的變異和漸趨苛刻的選擇。通過誘變PCR連續(xù)強化的變異，在擴增文庫的同時增加文庫的多樣性；通過漸趨苛刻的選擇以提高候選序列入選率。采用Dot blotting和Eastern blotting作為檢測手段，檢測特異性抗人精子適體的富集程度。最后在第40輪的文庫中挑選

3、出與精子結(jié)合的候選克隆進(jìn)行鑒定、測序，獲得6條適體分子序列。
　　以挑選出的候選克隆為模板，利用 PCR和單鏈 DNA分離技術(shù)制備相應(yīng)的適體分子，對獲得的適體分子進(jìn)行Dot blotting檢測?；贒ot blotting檢測結(jié)果分析，挑選出與人精子蛋白特異性結(jié)合能力較強的兩條適體分子，即 Ap-8和Ap-9，進(jìn)行后續(xù)的Eastern blotting檢測和熒光檢測。上述三組檢測實驗結(jié)果均表明通過cell-SELEX篩選獲得的A

4、p-8和Ap-9兩條適體分子具有較強的特異性結(jié)合人精子細(xì)胞的能力。
　　參照《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》內(nèi)毛細(xì)管測試實驗，設(shè)計體外抑精運動檢測實驗。從所在課題組歷來建立的抗人精子的適體分子庫中挑選出20條適體分子進(jìn)行體外抑精運動能力的檢測。實驗結(jié)果表明2號適體Y1623rc1，10號適體a-2Rc，11號適體a-5，12號適體a-6Rc，13號適體a-12Rc，15號適體Ap-9和19號適體Ap-