表達(dá)綠色熒光蛋白的重組山羊痘病毒的構(gòu)建以及牛流熱G蛋白在痘苗病毒中的表達(dá).pdf

1、山羊痘病毒(Goat pox virus，GPV)宿主范圍明確，主要為山羊、綿羊和牛等反芻獸，對其他哺乳動物不形成復(fù)制性感染，對人類不具有感染性和致病性，使用起來比較安全。由于其基因組結(jié)構(gòu)背景明確，具有高度的遺傳穩(wěn)定性，對外源基因插入耐受性強，而且容易組裝，可以允許大片段的基因丟失或刪除，至少可容納長達(dá)25kb的外源片段而不喪失感染力，因而它在病毒學(xué)、免疫學(xué)和疫苗學(xué)研究領(lǐng)域中扮演了十分重要的角色。國外近年來有將其作為疫苗載體的研究報道，

2、并有不少有關(guān)反芻獸類大動物的病毒保護(hù)性抗原基因在GPV疫苗載體表達(dá)系統(tǒng)中獲得了表達(dá)，顯示出良好的應(yīng)用前景。我國目前有不少實驗室也有這方面的研究，但進(jìn)展甚微。以我國自行培養(yǎng)并得到廣泛應(yīng)用的GPV疫苗株為親本，以復(fù)制非必需胸苷激酶基因(tk)作為外源基因插入靶點及同源重組臂，在利用轉(zhuǎn)移載體pTK-Lacz-GFP及其與GPV發(fā)生同源重組獲得的病毒(rGPV-LacZ-GFP)驗證了外源基因β-半乳糖苷酶(LacZ)和綠色熒光蛋白基因(gfp

3、)，在背靠背啟動子p11和p7.5啟動下成功穩(wěn)定表達(dá)后，將轉(zhuǎn)移載體LacZ基因更換為gpt(黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因(pTK-GPT-GFP)，利用MPA阻斷核酸代謝途徑篩選并獲得了遺傳穩(wěn)定表達(dá)的單一純化病毒克隆(rGPV-GPT-GFP)。本研究建立了表達(dá)外源基因重組山羊痘病毒構(gòu)建系統(tǒng)及其克隆純化方法，為進(jìn)一步開展GPV活載體疫苗研制及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了技術(shù)平臺。 另外，本試驗還構(gòu)建了一個以pSCll載體為骨架的表達(dá)牛流熱(Bo

4、vine ephemeralfever virus,BEFV)糖蛋白(Glycoprotein，G蛋白)的重組VV轉(zhuǎn)移載體。即在已經(jīng)存在背靠背啟動子P7.5和P11(P11啟動子的下游已經(jīng)插入篩選基因LacZ)的原有pSCll載體中，將來自牛流熱的G蛋白基因插入P7.5下游，與VV親本株WR共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。通過4代蝕斑純化后獲得重組毒rVV-BEFV-G，將其做間接免疫熒光實驗，檢測BG蛋白作為抗原的反應(yīng)原性，結(jié)果表明在重組痘苗病