細(xì)胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達(dá)、分離與純化.pdf

1、細(xì)胞間粘附分子1（intracellular adhesion molecule-1 ICAM-1）是一種細(xì)胞表面單鏈糖蛋白，參與抗原識(shí)別、補(bǔ)體結(jié)合、細(xì)胞粘附功能。可溶性細(xì)胞間粘附分子1（soluble intracellular adhesion molecule-1 sICAM-1）為細(xì)胞表面ICAM-1脫落所形成，其表達(dá)是導(dǎo)致Graves’病發(fā)生的重要因素之一，并且其血清水平對(duì)于判斷Graves’病的停藥和復(fù)發(fā)具有重要意義。ICA

2、M-1的免疫功能主要集中在膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)，本實(shí)驗(yàn)室張志友等已完成了對(duì)該功能區(qū)基因的克隆及融合蛋白的表達(dá)，并用所得到的融合蛋白初步免疫家兔制備了多抗。國外雖然有商品ICAM-1膜外區(qū)全長的抗原，但是性能不穩(wěn)定，不能滿足標(biāo)記純度的要求，且價(jià)格昂貴，因此如能進(jìn)一步得到ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白純品，用來做抗原標(biāo)準(zhǔn)，即可建立檢測(cè)人血清sICAM-1含量的超微量分析技術(shù)，進(jìn)而建立更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)方法，符合我國國情，將會(huì)有一定的經(jīng)濟(jì)意義和明

3、顯的臨床應(yīng)用前景。 目的： 1.原核表達(dá)GST-ICAM-1膜外Ⅰ-Ⅲ功能區(qū)融合蛋白，純化后用凝血酶酶切融合蛋白去除GST標(biāo)簽，應(yīng)用免疫親和層析和高壓液相方法探索蛋白分離純化的最優(yōu)條件，以獲取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 2，構(gòu)建重組質(zhì)粒ZPET28aICAM-1，原核表達(dá)只帶His標(biāo)簽的融合蛋白HisTag-ICAM-1，以獲取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 方法： 1.利用本室構(gòu)建并

4、保存的重組ZpET42aICAM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.ColiBL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化，得到GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白。應(yīng)用凝血酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切，SDS-PAGE電泳鑒定酶切結(jié)果。用飽和硫酸銨法從本室制備的含兔抗人ICAM-1的兔血清中粗提IgG，再用Protein A Sepharose CL-4B凝膠進(jìn)行IgG的進(jìn)一步提純，得到兔抗人ICAM-1的IgG純品

5、，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，用于CNBr-activited Sepharose CL-4B凝膠免疫親和層析，得到ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白；此外還探索應(yīng)用高壓液相方法對(duì)酶切后蛋白進(jìn)行分離純化。 2.構(gòu)建重組質(zhì)粒ZPET28aICAM-1，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.Coli BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化，得到His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。SDS-PAGE電泳鑒定

6、蛋白純化結(jié)果并計(jì)算分子量，Western Blot檢測(cè)His-ICAM-1的免疫活性，考馬斯亮藍(lán)染色法定量，即可初步得到具有免疫學(xué)活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 結(jié)果： 1.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的免疫親和層析分離、純化 重組質(zhì)粒ZpET42aICAM轉(zhuǎn)化宿主菌后在最佳條件下表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化。凝血酶在4℃酶切60小時(shí)，可以將GST-ICAM-1膜外

7、Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白完全酶切開，SDS-PAGE電泳顯示酶切后得到兩條條帶，即：ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，分子量為38.2kD和GST蛋白，分子量為28.0kD。開始免疫親和層析后從3ml兔抗血清中用飽和硫酸銨法和Protein A凝膠親和層析法提純兔抗人ICAM-1 IgG純品，獲得約6mg，再用于CNBr-activited Sepharose CL-4B凝膠進(jìn)行的免疫親和層析，初步得到具有免疫學(xué)活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ

8、功能區(qū)蛋白。 2.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的高壓液相法分離、純化 凝血酶酶切后經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示兩條明顯的條帶，即GST和ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，經(jīng)改變條件反復(fù)探索確定應(yīng)用HPIC法流動(dòng)相為3％乙腈，0.02％TFA，0.02M乙酸銨，PH值為6.0，在此條件下進(jìn)樣收集樣品濃縮處理后，作SDS-PAGE和Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)雖有免疫學(xué)活性但是GST和ICAM-1膜外Ⅰ～

9、Ⅲ功能區(qū)蛋白未完全分開，依然顯示兩條條帶。 3.His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 構(gòu)建重組質(zhì)粒ZPET28aICAM-1，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.Coli BL21（DE3），以IPTG為誘導(dǎo)劑，濃度1mM，20℃誘導(dǎo)6小時(shí)。表達(dá)產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化。純化后His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，產(chǎn)率為4.0 mg/L培養(yǎng)基。 結(jié)論： 1.成功地用抗體免疫親和

10、層析方法分離ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白和GST，得到具有免疫學(xué)活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 2.應(yīng)用HPLC方法分離ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白和GST，可以得到具有免疫學(xué)活性的蛋白，但是分離效果不甚理想，SDS-PAGE鑒定，依然顯示兩條條帶。 3.成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒ZPET28aICAM-1，Ni-NTA親和層析純化后可得到具有免疫學(xué)活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。因只帶His標(biāo)簽，可