HSV-1感染對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞和角膜上皮細胞的影響.pdf

1、第一部分HSV-1感染對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長的影響 目的：建立單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinalpigmentepithelialcell，RPE)的體外模型，觀察HSV-1感染對體外培養(yǎng)RPE細胞生長的影響。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)為5的HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)的RPE細胞。

2、用相差顯微鏡觀察RPE細胞的形態(tài)變化；用MTT法、流式細胞術(shù)觀察HSV-1感染對RPE細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響；用PCR和免疫熒光法驗證HSV-1感染RPE細胞是否成功。 結(jié)果：成功在體外建立了HSV-1感染RPE的細胞模型。HSV-1感染RPE細胞8h后出現(xiàn)病變，細胞形態(tài)開始變得細長和皺縮；感染24h后細胞病變更加明顯，細胞間間隙增加，甚至可見多核巨細胞；感染48h后所有細胞均變圓，細胞開始出現(xiàn)脫落甚至死亡。MTT結(jié)果顯

3、示HSV-1感染RPE24h和48h后能抑制細胞生長(P<0.01)，細胞的抑制率分別為(16.37±3.28)％和(47.91±6.39)％；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)HSV-1感染可影響RPE細胞的細胞周期，但對細胞凋亡無明顯影響。 結(jié)論：HSV-1能感染體外培養(yǎng)的RPE細胞，抑制RPE細胞的增殖，并影響RPE細胞的細胞周期。 第二部分HSV-1感染對人角膜上皮細胞及其TGF—βs和SMADs表達的影響 目的：建立單

4、純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人角膜上皮細胞(humancornealepithelialcell，HCE)的體外模型，觀察HSV-1感染對HCE細胞中TGF—βs(TGF—β1、TGF—β2和TGF—β3)和SMADs(SMAD2和SMAD3)表達的影響。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)為5的HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)的HCE細胞

5、。在HSV-1感染HCE細胞0、4、8、12和24小時后，用相差顯微鏡觀察HCE細胞的形態(tài)變化；用RT—PCR(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)檢測HCE細胞中TGF—βs(TGF—β1、TGF—β2和TGF—β3)和SMADs(SMAD2和SMAD3)基因的表達；用間接免疫熒光法觀察HCE細胞中TGF—β1、TGF—β2，SMAD3和磷酸化SMAD3蛋白的表達；同時還用ELISA

6、的方法檢測了HSV-1感染HCE細胞后TGF—β1蛋白的表達。 結(jié)果：HSV-1感染HCE細胞后，同正常HCE細胞形態(tài)相比較，感染后8hHCE細胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細胞間間隙增加，可見較多多核巨細胞，感染24h后細胞病變更加明顯，細胞開始出現(xiàn)脫落甚至死亡；RT—PCR結(jié)果顯示TGF—β1在HSV-1感染HCE8h后表達開始降低，12h和24h降低更為明顯(p<0.01)，SMAD3在HSV-1感染HCE12h和24h后表達顯著降低，

7、而TGF—β2、TGF—β3和SMAD2基因表達無明顯變化；間接免疫熒光結(jié)果顯示TGF—β1、SMAD3和磷酸化SMAD3蛋白在HSV-1感染HCE12h和24h后表達較正常HCE細胞降低，而TGF—β2蛋白表達無明顯變化；同時ELISA結(jié)果亦顯示HSV-1感染HCE12h和24h后TGF—β1蛋白表達降低。 結(jié)論：HSV-1能感染體外培養(yǎng)的HCE細胞，TGF—β1和SMAD3可能參與了HSV-1感染角膜上皮細胞的病理過程。

8、 第三部分HSV-1感染人角膜上皮細胞后病毒miRNA的表達變化 目的：建立單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人角膜上皮細胞(humancornealepithelialcell，HCE)的體外模型，觀察不同濃度的HSV-1感染HCE細胞后病毒miRNA的表達變化。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)分別為5，1和0.1的HSV-

9、1(F株)感染體外培養(yǎng)的HCE細胞，在HSV-1感染HCE細胞24小時后，用RealtimePCR方法檢測HCE細胞中病毒miRNA(hsv—miR—H1～hsv—miR—H6)的相對量。 結(jié)果：在正常細胞中病毒miRNA均無表達；在HSV-1感染HCE細胞中僅hsv1-miR—H6有表達，其它miRNA無表達或表達非常低，且以MOI=0.1組作為對照時，MOI為5時hsv1-miR—H6的相對量為其的4.86倍，MOI為1時h