長鰭吻鮈微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)研究.pdf

1、長鰭吻鮈（Rhinogobio ventralis Sauvage et Dabry）主要分布于金沙江、岷江、雅礱江、沱江、烏江下游、嘉陵江中下游以及長江上游干流等流域，是一種習(xí)慣于在急流險(xiǎn)灘、亂世交錯(cuò)的江河底層等黑暗水環(huán)境活動(dòng)的底棲小型魚類，屬典型的流水性種類。長鰭吻鮈又俗稱土耗兒，為我國長江上游特有物種，屬于“長江上游珍稀特有魚類國際級(jí)保護(hù)區(qū)”保護(hù)名錄中66種特有魚類之一。近些年來，長江上游各大型梯級(jí)水利工程的相繼建設(shè)，人類過度捕撈

2、與開發(fā)利用，長鰭吻鮈種群自然資源量呈急劇下降趨勢(shì)。從物種價(jià)值及其受威脅程度評(píng)估發(fā)現(xiàn)，長鰭吻鮈已達(dá)3級(jí)急切保護(hù)狀，被列為低危魚類。對(duì)此，國內(nèi)多家增值放流站已將長鰭吻鮈列為增值放流對(duì)象，對(duì)長鰭吻鮈馴化養(yǎng)殖與人工繁殖技術(shù)等方面的研究日益受到重視。本文以長鰭吻鮈為主要研究對(duì)象，通過篩選出的多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)構(gòu)建了長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR體系，并將其用于長鰭吻鮈野生親本種群的遺傳特性分析，同時(shí)建立了基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定技術(shù)，

3、旨在為長鰭吻鮈人工繁殖、家系管理以及增值放流效果評(píng)估等工作提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。其主要研究結(jié)果如下：
　?。?）長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR技術(shù)的建立與優(yōu)化
　　從NCBI基因文庫中獲取了長鰭吻鮈70個(gè)微衛(wèi)星序列，并根據(jù)已報(bào)道的相應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)選取33個(gè)多態(tài)性相對(duì)較高的位點(diǎn)合成引物，在12個(gè)野生長鰭吻鮈個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染法檢測(cè)后，挑選出多態(tài)性較高、擴(kuò)增效果最好的15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)用以開

4、發(fā)多重PCR體系。通過對(duì)退火溫度以及對(duì)反應(yīng)體系中可能影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素分別進(jìn)行了優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)最終建立了5組微衛(wèi)星熒光多重PCR（組合A、B、C、D和E），每組含有3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。
　　（2）基于微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長鰭吻鮈瀘州野生親本種群遺傳多樣性的評(píng)估
　　利用長鰭吻鮈15個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及其所構(gòu)建的微衛(wèi)星熒光多重PCR技術(shù)，對(duì)長江上游瀘州江段采集的40尾長鰭吻鮈野生親本群體進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估以及遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果共檢測(cè)到等位

5、基因數(shù)為234個(gè)，平均等位基因數(shù)為15.600，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為5（REN02）―23（REN17、RVE-13）；多態(tài)信息含量為0.729―0.940，平均多態(tài)信息含量為0.872；期望雜合度為0.77825―0.95506，平均期望雜合度為0.89600；觀測(cè)雜合度為0.55263―0.97500，平均觀測(cè)雜合度為0.82691，表明種群遺傳多樣性處于較高水平。近交系數(shù)為-0.06283―0.29267，平均值為0.07961（

6、P=0.00000±0.00000）。微衛(wèi)星位點(diǎn)之間未出現(xiàn)顯著的連鎖不平衡現(xiàn)象。除位點(diǎn)REN16、RV-8、REN34、RVE-13和REN02外，其他位點(diǎn)均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡（P＜0.05）。利用Structure軟件聚類分析表明該長鰭吻鮈種群未出現(xiàn)遺傳分化。瓶頸效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明該長鰭吻鮈種群個(gè)體數(shù)量有所下降，近期經(jīng)歷了嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)。
　　（3）基于微衛(wèi)星熒光多重 PCR的長鰭吻鮈親子鑒定技術(shù)的建立及子一代遺傳特征評(píng)估<

7、br>　　利用長鰭吻鮈15個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及其所構(gòu)建的微衛(wèi)星熒光多重PCR體系，建立了鰭吻鮈親子鑒定技術(shù)。結(jié)果顯示，無論親本基因型是否已知，其累積排除概率均大于99.99％；當(dāng)僅使用多重PCR組合A、B和C時(shí)，在雙親基因型未知和單親基因型已知的情況下，其累積排除概率分別為99.83%和99.99%，因此可以認(rèn)定親本和子代之間存在親子關(guān)系。研究結(jié)果表明15個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記所構(gòu)建的長鰭吻鮈微衛(wèi)星熒光多重PCR親子鑒定技術(shù)是可靠的。對(duì)長鰭吻鮈人工繁

8、殖子一代群體遺傳多樣性評(píng)估結(jié)果顯示，共檢測(cè)到的等位基因數(shù)為98個(gè)，平均等位基因數(shù)為6.533，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為4―10；多態(tài)信息含量為0.579―0.879，平均多態(tài)信息含量為0.730；期望雜合度為0.606―0.894，平均期望雜合度為0.766；觀測(cè)雜合度為0.458―1.000，平均觀測(cè)雜合度為0.808。表明長鰭吻鮈F1子代群體的遺傳多樣性較高。F1子代群體總近交系數(shù)（FIT）為0.01469，單個(gè)群體內(nèi)近交系數(shù)（FIS）