膠體金層析技術快速檢測中藥中赭曲霉毒素A研究.pdf

1、膠體金標記技術是繼熒光素標記、放射性同位素標記和酶標記三大重要標記技術后的又一重要標記技術，已在生物醫(yī)學、藥物殘留、激素檢測、危險品檢測、毒品快速檢測、臨床診斷、離子檢測、食品安全檢測等領域得到了廣泛應用。膠體金層析技術是膠體金標記技術與層析技術良好結合的新技術，按照與膠體金顆粒相結合物質類別的差異，可分為膠體金免疫層析法和膠體金適配子層析法。
　　赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬等產(chǎn)生的有毒

2、代謝產(chǎn)物，對人和動物的生命健康危害極大，有很強的腎毒性及致癌、致畸和免疫抑制作用等，有研究指出，它主要通過促進膜的過氧化，抑制線粒體呼吸作用亦或是影響細胞信號傳導過程中蛋白和其他關鍵因子的轉錄表達等過程從而產(chǎn)生致毒效應，已被國際癌癥組織(IARC)定義為人類可能的致癌物（2B級）。中藥材作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學的精華，使用歷史悠久。然而，中藥同糧食、谷物等眾多農(nóng)作物一樣，種植、生長、采收、加工、炮制以及儲存等過程中，均可能受曲霉菌屬和青霉菌屬等

3、真菌污染進而產(chǎn)生赭曲霉毒素A，很有必要建立靈敏準確的中藥中OTA快速檢測技術。基于此，本論文建立了中藥中OTA的膠體金層析快速檢測技術，并采用液質聯(lián)用技術對新技術檢測結果進行確證。主要研究內容和結論如下:
　　(1)建立了膠體金免疫層析方法快速檢測赭曲霉毒素A(OTA)。
　　采用Frens法制備合適粒徑的膠體金溶液，并用紫外分光光度計在400-800nm進行全波長掃描，計算膠體金顆粒粒徑，透射電鏡下觀察顆粒表觀，形狀以及大

4、小等。反復試驗，最終確定及穩(wěn)定所需粒徑的膠體金溶液燒制方法?？疾炷z體金標記抗體最低穩(wěn)定量以及膠體金標記抗體最適pH，同時篩選檢測線、控制線溶液濃度以及耗材型號等，選擇最佳條件制備試紙條。進行試紙條性能考察，結果發(fā)現(xiàn)，所制備試紙條穩(wěn)定，可長期保存，對OTA的檢測靈敏度為5 ng/mL，且特異性良好，不與其他真菌毒素發(fā)生交叉反應。
　　(2)建立了膠體金適配子層析方法快速檢測赭曲霉毒素A(OTA)。
　　制備合適粒徑的膠體金溶液

5、，考察膠體金標記適配子最低穩(wěn)定量，注意考察優(yōu)化最佳偶聯(lián)條件，同時篩選檢測線、控制線溶液濃度以及耗材型號等，選擇最佳條件制備試紙條。進行試紙條性能考察，其靈敏度為5 ng/mL，并且特異性良好，不與其他真菌毒素發(fā)生交叉反應。且相較膠體金免疫層析試紙條，成本明顯降低。試紙條檢測試驗可重復，且長期保持穩(wěn)定。
　　(3)建立了檢測中藥中OTA的UFLC-MS/MS方法，并對膠體金免疫層析試紙條和膠體金適配子層析試紙條的檢測結果進行驗證。<

6、br>　　樣品經(jīng)80％的甲醇（水）溶液提取，以水（含0.1％甲酸）/乙腈（含0.1％甲酸）為流動相，采用梯度洗脫的方法進行液相色譜分離，在多反應監(jiān)測模式(MRM)下，1.0-40.0 ng/mL范圍內，OTA的線性相關系數(shù)分別為0.9993。 OTA高中低三個添加水平的回收率在78.83％～91.74％之間，相對標準偏差在1.39％～6.24％之間。該方法簡單快速、靈敏度高和選擇性好，適用于中藥中真菌毒素OTA的檢測。采用所建立的UFL