超順磁性氧化鐵磁共振造影劑的制備工藝研究及藥效學(xué)探討.pdf

1、隨著外科技術(shù)的迅速發(fā)展，人們要求影像學(xué)能檢出更小的病變，更準(zhǔn)確地定性，使得磁共振造影劑的研究備受關(guān)注。SPIO(超順磁氧化鐵)作為目前磁共振造影劑的研究熱點(diǎn)，具有肝臟特異性，即主要由肝臟正常組織中的枯否氏細(xì)胞吞噬，而腫瘤組織由于缺乏該類細(xì)胞，使得SPIO在腫瘤部位含量低，從而可通過磁共振檢查將正常與病變組織區(qū)分出來。SPIO在肝臟局灶性病變尤其是小肝癌、微小肝癌的檢出率、定性鑒別診斷方面，開創(chuàng)了細(xì)胞功能與影像結(jié)合的新天地，使得肝臟疾病診

2、斷程序變得更為簡(jiǎn)單、迅捷。此外，USPIO(超細(xì)順磁氧化鐵)造影劑在受體等介導(dǎo)的磁標(biāo)記探針成像的應(yīng)用前景也引起人們的廣泛注意。所謂磁標(biāo)記探針是指將順磁性粒子以某種方式與特異性受體、抗體或基因結(jié)合轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，由于該順磁性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積與所連接的物質(zhì)數(shù)量成正比，因此，順磁性物質(zhì)引起的MR信號(hào)分布代表了受體、抗體或基因的分布，而通過順磁性標(biāo)記的配體，在受體介導(dǎo)下，產(chǎn)生特異性濃集，達(dá)到選擇性強(qiáng)化進(jìn)而成像的目的。 方法與內(nèi)容：

3、 1.超順磁性氧化鐵的制備與理化性質(zhì)研究 1.1超順磁性葡聚糖氧化鐵納米顆粒的制備及工藝優(yōu)化 采用化學(xué)共沉淀法，用不同分子量的葡聚糖和不同分子量硫酸軟骨素制備Fe3O4納米粒，用Malvern-3000HS光子相關(guān)光譜儀測(cè)定磁流體的粒徑及其分布，同時(shí)，在透射電鏡下觀察納米粒子的大小和形態(tài)。比較數(shù)均粒徑結(jié)果與透射電鏡測(cè)得的平均粒徑結(jié)果，以判斷包裹層的厚度。 考察影響因子有：葡聚糖用量、堿的濃度、鐵鹽和亞鐵鹽的比例及

4、濃度、反應(yīng)溫度、攪拌速度等對(duì)粒子大小的影響。 1.2超順磁性氧化鐵造影劑純化 分別使用截留分子量為14000的透析袋、葡聚糖SephacryS-300HR凝膠色譜柱和超濾離心管(100KD)，對(duì)制備的SPIO進(jìn)行純化。制備出符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)的造影劑。 1.3SPIO磁共振造影劑的表征及理化性質(zhì) 分別使用光學(xué)顯微鏡、電子透射電鏡、Malvern-3000HS光子相關(guān)光譜儀、X-射線粉末衍射法(X-raypo

5、wderdiffraction，XRD)技術(shù)和核磁共振儀考察超順磁性氧化鐵造影劑的形態(tài)、粒徑分布、晶體結(jié)構(gòu)、飽和磁化強(qiáng)度和弛豫率等。 1.4超順磁性葡聚糖氧化鐵中鐵含量的測(cè)定 利用鐵離子與鹽酸羥胺、鄰菲羅啉的化學(xué)反應(yīng)，采用分光法測(cè)定鐵含量。 1.5超順磁性葡聚糖氧化鐵中葡聚糖含量的測(cè)定 用陽離子交換樹脂消除鐵的干擾后，利用葡聚糖與苯酚的特異性生色反應(yīng)測(cè)定超順磁性葡聚糖氧化鐵中葡聚糖的含量。 2.超

6、順磁性氧化鐵造影劑的穩(wěn)定性與安全考察 2.1超順磁性氧化鐵造影劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)考察 本文選擇了121℃，30min熱壓滅菌、熱加速、強(qiáng)光照射及一年半的常溫留樣觀察等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)自制SPIO磁共振造影劑外觀性狀、鐵含量、pH值、粒徑分布、飽和磁化率等參數(shù)的影響，來評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。 2.2超順磁性氧化鐵造影劑急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 本實(shí)驗(yàn)分別采用尾靜脈注射和腹腔注射2種不同的給藥方式，按低、中、高三劑量組給予小鼠超順磁

7、性氧化鐵注射劑，觀察小鼠的急性中毒表現(xiàn)和死亡情況，以及主要臟器的病理學(xué)變化。 3.超順磁性氧化鐵增強(qiáng)對(duì)比劑的藥效學(xué)研究 3.1SPIO增強(qiáng)大鼠肝臟磁共振成像實(shí)驗(yàn)研究 使用西門子Impact1.5T超導(dǎo)磁共振成像儀，給正常大鼠經(jīng)尾靜脈注射自制SPIO造影劑前及50min后以相同條件行增強(qiáng)掃描。分析圖像，并對(duì)受試大鼠進(jìn)行病理檢查，以觀察造影劑的組織損害。 3.2SPIO增強(qiáng)移植型肝癌模型大鼠的磁共振成像實(shí)驗(yàn)研

8、究 按常規(guī)方法于雄性SD大鼠選取最近體表的肝葉(體積最大)移植Walker-256瘤株。術(shù)后5～8天，于腫瘤長(zhǎng)至大小在0.2cm～1.5cm之間時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射自制SPIO造影劑或生理鹽水，50min后以西門子Impact1.5T超導(dǎo)磁共振成像儀相同條件行增強(qiáng)掃描。分析圖像，并對(duì)受試大鼠進(jìn)行病理檢查，以觀察造影劑的組織損害。 4.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的USPIO磁共振增強(qiáng)研究 取自制USPIO(核心粒徑為4～8nm)

9、溶液經(jīng)高碘酸處理后，在硼氫化鈉存在下與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶合，置備Tf-USPIO磁性探針。用紅外光譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 以USPIO和Tf-USPIO分別與HepG2細(xì)胞孵育。透射電鏡下觀察細(xì)胞對(duì)鐵的吞噬作用。用磁共振成像儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的MRI檢測(cè)，觀察造影劑對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的影響。 結(jié)果： 1.超順磁性氧化鐵的制備與理化性質(zhì) 采用化學(xué)共沉淀法，成功制備出超順磁性氧化鐵。其核心在電鏡下顯示為分散均勻、圓整的顆粒，有少許團(tuán)

10、聚現(xiàn)象，由電鏡估算其平均粒徑，普通SPIO為15nm左右，USPIO為4～8nm。用光子相關(guān)光譜儀測(cè)定時(shí)，前者體均粒徑dv=85.9nm；后者體均粒徑dv=21.4nm。XRD衍射物相分析表明，SPIO粒子的XRD譜分別在30.11°，35.45°和62.59°時(shí)出現(xiàn)主要衍射峰，其位置與Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)譜圖中的位置一致，證明所合成的SPIO確實(shí)為Fe3O4納米粒子。利用MPMSXL-7磁學(xué)性質(zhì)測(cè)量系統(tǒng)，測(cè)得樣品的質(zhì)量飽和磁化強(qiáng)度為80e

11、mu/gFe，不低于SPIO要求的最低質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)41emu/gFe。當(dāng)外加磁場(chǎng)為0時(shí)，SPIO幾乎沒有剩磁，具有超順磁性。在核磁共振診斷儀上用SE序列T2W1條件，測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度隨鐵濃度變化所對(duì)應(yīng)的值，自制樣品的SPIO的弛豫率為0.1567mmol-1·msec-1(或0.1567×106mol-1·sec-1)，高于SPIO作為磁共振造影劑T2弛豫率需大于0.062×106mol-1·sec-1的最低標(biāo)準(zhǔn)。 為控制制劑質(zhì)量，我們

12、所采用的測(cè)定SPIO中鐵、葡聚糖含量的方法，在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)呈良好線形關(guān)系，精密度、重現(xiàn)性符合要求，能夠作為質(zhì)量控制的有效手段。 透析和SephacryS-300HR凝膠色譜柱層析對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈兎謩e除去游離的鐵離子和葡聚糖，利用超濾過程我們可以調(diào)整溶液中鐵的含量，使之達(dá)到有效濃度。 2.超順磁性氧化鐵造影劑的穩(wěn)定性與安全性 分別取自制的SPIO磁共振造影劑在121℃，30min熱壓滅菌；置隔水式

13、電熱恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度40℃±2℃，RH約為75％，放置6個(gè)月；置留樣觀察室常溫放置一年半；在光照強(qiáng)度達(dá)到45001x±5001x的光櫥中，放置10天；SPIO樣品的性狀無明顯改變，鐵含量、pH值、粒徑大小及粒徑分布、飽和磁化率等參數(shù)與實(shí)驗(yàn)前的數(shù)據(jù)基本一致。 正常小鼠尾靜脈注射自制的SPIO最大劑量達(dá)267.5/kg，腹腔注射劑量1123.5mg/kg的情況下，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期間，各組動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡。因此小鼠靜脈注射LD50＞2

14、67.5mg/kg，腹腔注射LD50＞1123.5mg/kg。觀察期末分別從高劑量組隨機(jī)抽取4～6只小鼠處死，解剖肉眼可見肝顏色呈深褐色，其余臟器未見明顯異常，作肝、腎病理檢驗(yàn)，未見明顯改變。 3.超順磁性氧化鐵增強(qiáng)對(duì)比劑的藥效學(xué) 正常大鼠注射SPIO膠體溶液前后肝臟的MR掃描結(jié)果表明：注射SPIO以后，正常肝臟的信號(hào)顯著減弱，說明SPIO膠體溶液明確具有降低弛豫時(shí)間，增強(qiáng)負(fù)性造影的作用。同時(shí)隨著SPIO劑量的增加，T1

15、及T2加權(quán)像肝臟的信號(hào)值均單向下降，T2加權(quán)像對(duì)小劑量SPIO更為敏感。病理檢查顯示肝細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，未見異常。 30只SD大鼠，用外科手術(shù)植入Walker-256瘤株的方法制作肝癌模型，成功27只，其中病理檢出計(jì)32個(gè)腫瘤，SPIO增強(qiáng)掃描T1WI檢出率為28.1％(9/32)，而SPIO增強(qiáng)掃描T2WI檢出率達(dá)93.8％(30/32)。 4.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的USPIO磁共振增強(qiáng)研究 取自制USPI

16、O(核心粒徑為4～8nm)溶液，經(jīng)高碘酸部分氧化后，與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶合后，再以硼氫化鈉還原，制備Tf-USPIO磁性探針。用紅外光譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 用磁共振成像儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的MRI檢測(cè)，觀察造影劑對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的影響。 在高碘酸處理后的USPIO紅外光譜圖中，與標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖圖譜最明顯的區(qū)別是在1732cm處多了一個(gè)醛基的C=O伸縮振動(dòng)峰。增加的醛基易于與轉(zhuǎn)鐵蛋白上的胺基生成C=N雙健，該化合物在還原劑硼氫化鈉作用下發(fā)生加氫還原

17、反應(yīng)。紅外光譜儀的結(jié)果證明了Tf-USPIO磁性探針的合成。 以USPIO和Tf-USPIO分別與HepG2細(xì)胞孵育后。透射電鏡下觀察到細(xì)胞對(duì)鐵的吞噬作用。細(xì)胞溶酶體的膜內(nèi)有許多呈圓形的顆粒，為鐵顆粒，鐵顆粒圓形的邊界有的清晰，有的較模糊，可能與吞噬USPIO顆粒的時(shí)間及對(duì)USPIO的水解程度有關(guān)。Tf-USPIO組比單純USPIO有更多的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。 結(jié)論： 在實(shí)驗(yàn)中我們制備的SPIO的理化性質(zhì)和文獻(xiàn)報(bào)道的資料一