順鉑聯(lián)合DC疫苗抗腫瘤作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為臨床進(jìn)行的常規(guī)放化療均不能有效地激活針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答；但近年來,越來越多的證據(jù)證明死亡的腫瘤細(xì)胞可釋放一些關(guān)鍵因子,或激活或抑制腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞。目前已觀察到多種化療藥如蒽環(huán)類抗生素、histone deacetylase inhibitors(HDACi)等在殺死腫瘤細(xì)胞時(shí),釋放hsp70、HMGB1等“危險(xiǎn)信號(hào)”,可激活宿主固有及獲得性免疫細(xì)胞；環(huán)磷酰胺(CY)也可以通過抑制免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-Re

2、g)增殖及活性提高腫瘤特異性免疫應(yīng)答。
　　 化療藥物對(duì)免疫功能的影響提示我們,適當(dāng)劑量化療后,聯(lián)合DC疫苗等免疫治療啟動(dòng)宿主主動(dòng)腫瘤免疫來進(jìn)行持續(xù)殺傷是可行的,而且很可能比單純依賴高劑量化療殺傷全部腫瘤細(xì)胞更為有效和安全。研究證明腫瘤免疫逃逸的機(jī)制不僅由于缺乏抗原,而且與抗原不能被有效提呈給T細(xì)胞而不能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答有關(guān)。因此腫瘤免疫治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)是如何使抗原被有效提呈而激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。我們前期的實(shí)驗(yàn)已觀察到

3、多種化療藥如紫杉醇、比柔吡星誘導(dǎo)的凋亡或壞死細(xì)胞具有較高的免疫原性,且能被體外培養(yǎng)的DC有效攝取。
　　 順鉑屬于細(xì)胞周期非特異性藥物,具有細(xì)胞毒性,可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程,并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu),有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。有關(guān)順鉑與DC疫苗是否具有協(xié)同抗腫瘤作用還鮮有報(bào)道。
　　 本研究首先觀察了臨床常用化療藥物順鉑作用B16腫瘤細(xì)胞后,對(duì)“危險(xiǎn)信號(hào)”HMGB1、hsp70表達(dá)的影響,同時(shí)對(duì)TGF-β的表達(dá)以及對(duì)順鉑處

4、理的B16細(xì)胞裂解液負(fù)載的樹突狀細(xì)胞(DC)的活性也進(jìn)行了分析。然后,本研究以荷瘤小鼠為模型,對(duì)順鉑聯(lián)合DC疫苗的抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 方法:
　　 1觀察順鉑對(duì)B16腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用
　　 用終濃度10μg/ml的順鉑處理體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞24h,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 2 HMGB1、hsp70及TGF-β蛋白表達(dá)水平檢測(cè)
　　 體外培養(yǎng)的小鼠

5、黑色素瘤B16細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用終濃度10μg/ml的順鉑處理24h,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Western blot方法觀察HMGB1、hsp70及TGF—β蛋白表達(dá)。
　　 3 DC疫苗的制備及其活性檢測(cè)
　　 從小鼠股骨獲得骨髓細(xì)胞,采用細(xì)胞因子GM—CSF與IL-4誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)分化。在培養(yǎng)的第5d,重新收集DC細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)

6、節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×106/ml,重新將細(xì)胞加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,用順鉑處理的野生型B16細(xì)胞裂解液負(fù)載DC,LPS誘導(dǎo)成熟。流式細(xì)胞儀分析DCs表面標(biāo)記MHCⅡ,ICAM-1,CD86的表達(dá)。
　　 4順鉑聯(lián)合DC疫苗抗腫瘤作用及其機(jī)制研究
　　 給荷瘤小鼠經(jīng)腹腔注射順鉑(100μg/只),連續(xù)3天,每天一次,然后于瘤內(nèi)注射DC疫苗(3×106/只),觀察腫瘤生長(zhǎng)曲線；對(duì)小鼠脾臟中腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌、CT

7、L活性、T-Reg細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí),對(duì)腫瘤組織中的CD8+T細(xì)胞數(shù)及T-Reg細(xì)胞數(shù)也進(jìn)行了觀察和分析。
　　 結(jié)果:
　　 1順鉑不僅可誘導(dǎo)B16腫瘤細(xì)胞凋亡(凋亡率為20％±4％),還可誘導(dǎo)B16細(xì)胞壞死；順鉑作用B16細(xì)胞24h后,可明顯提高其HMGB1表達(dá)水平,但對(duì)hsp70及TGF-β的表達(dá)影響不大。
　　 2順鉑處理的B16細(xì)胞裂解液可明顯促M(fèi)HCⅡ,ICAM-1,CD86的表達(dá)(順鉑處理組MH

8、CⅡ,ICAM-1,CD86分別為:47％±11％,39％±7％,35％±5％；未經(jīng)順鉑處理組5.6％±2％,3.2％±1.4％,4.1±0.7％),表明用該方法可誘導(dǎo)DC成熟、活化。
　　 3順鉑聯(lián)合DC疫苗對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；還可促進(jìn)荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CTL活性和IFN-γ產(chǎn)生(P<0.05或P<0.01),但對(duì)脾臟調(diào)節(jié)性T(T-Reg)的作用不明顯；另外,順鉑聯(lián)合DC疫苗可增加腫瘤組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD

9、8+數(shù),而下調(diào)調(diào)節(jié)性T(T-Reg)細(xì)胞數(shù),使CD8+/T-Reg的比例提高。
　　 結(jié)論:
　　 1順鉑以誘導(dǎo)B16腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死的混合方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；
　　 2適當(dāng)濃度順鉑處理B16腫瘤細(xì)胞后,增加HMGB1蛋白的表達(dá),對(duì)hsp70及TGF-β的表達(dá)作用不明顯；
　　 3用順鉑處理的B16細(xì)胞裂解液負(fù)載DC,可促進(jìn)DC的成熟與活化；
　　 4順鉑與DC疫苗具有協(xié)同抗腫瘤作用；