黑麥屬種質(zhì)資源分子生物學(xué)研究.pdf

1、黑麥屬(SecaleL.)是小麥的三級(jí)基因源，其中蘊(yùn)藏著豐富的遺傳變異，是改良小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性和抗逆性的重要基因資源。為合理有效地利用該基因資源，有必要綜合應(yīng)用各種技術(shù)，進(jìn)一步闡明黑麥屬遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。本研究應(yīng)用SDS-PAGE、SSR、5SrRNA等生化及分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)黑麥屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性及物種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了研究。同時(shí)，利用普通小麥LMW-GS引物序列對(duì)黑麥屬LMW-GS類似基因進(jìn)行了分離克隆，并通過序列

2、比較分析其與小麥、大麥和黑麥各種貯藏蛋白基因間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下： 1.黑麥屬72份材料SDS-PAGE分析結(jié)果表明，黑麥屬貯藏蛋白與普通小麥不同，可明顯區(qū)分為4種類型：HMW、γ-75k、ω和γ-40k。在72份材料中共檢測到54種貯藏蛋白帶型，每份材料分離出7-11條帶，多數(shù)9-10條。在HMW區(qū)檢測到6種亞基，21種不同組合。γ-40k區(qū)多為3條帶，其它區(qū)域均以2條帶最為普遍。各區(qū)域均存在一定變異，但以HMW-GS和

3、γ-40區(qū)變異最大。供試材料平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.748，變幅為0.450-1.000。S.sylvestre種內(nèi)的GS值(0.970)較高，S.cereale種內(nèi)的GS值(0.797)較低。S.sylvestre與S.cereale的種間GS值(0.633)最低，且與其它2個(gè)種的種間GS值(＜0.700)也均較低。S.vavilovii與S.cereale的種間GS值高達(dá)0.785。栽培黑麥不同洲內(nèi)及洲際材料間的遺傳相似系數(shù)均

4、較接近。聚類分析不能將72份材料完全區(qū)分開來，S.sylvestre與其它物種差異明顯，S.vavilovii與S.cereale具有較近的遺傳關(guān)系，而其它物種的聚類較為混雜。這些結(jié)果說明，SDS-PAGE分析可以在一定程度上反映黑麥屬物種間的親緣關(guān)系，但不能有效地揭示不同地理來源栽培黑麥間的遺傳關(guān)系。 2.應(yīng)用SSR標(biāo)記分析黑麥屬遺傳多樣性及親緣關(guān)系結(jié)果表明，24個(gè)黑麥微衛(wèi)星引物(SCM)在30份黑麥屬不同物種材料中平均多態(tài)性

5、信息含量(PIC=0.604)比在47份不同地理來源栽培黑麥中的(0.471)高；黑麥屬物種平均遺傳相似系數(shù)(GS=0.633)低于栽培黑麥(0.773)。S.sylvestre種內(nèi)的平均GS值最大，而S.strictum種內(nèi)的最小。S.cereale和S.vavilovii的種間平均GS值最大，而S.sylvestre和S.cereale的最小。來源于亞洲、歐洲、北美洲和南美洲的GS值沒有明顯差異。聚類分析表明，S.sylvestre

6、與其它物種差別最大，可以明顯區(qū)分，而S.vavilovii和S.cereale遺傳距離最小，聚為同一大類。S.strictum種內(nèi)存在很大的遺傳分化。這些結(jié)果說明，由SSR標(biāo)記獲得的聚類圖能夠真實(shí)地反映黑麥屬種的水平上的系統(tǒng)親緣關(guān)系，但不能很有效地揭示不同地理來源的栽培黑麥材料的馴化過程。 3.從黑麥屬4個(gè)種10個(gè)亞種共23份材料中總共獲得129個(gè)5SrRNA基因序列，將這些序列分別劃歸入兩種長度單元：480bp的長單元(10n

7、gR1)和460bp的短單元(shortR1)。依據(jù)5SrDNA序列差異不能有效區(qū)分黑麥屬各物種。利用BLAST搜索到分別與longR1和shortR1一致性高的兩套5SrDNA單元序列：1)longR1(Secale)+longP1(Agropyron；Kengyilia)+longJ1(Thinopyrum)；2)shortR1(Secale)+longS1(Pseudoroegneria；Kengyilia)+shortJl(Th

8、inopyrum)+shortV1(Dasypyrum)。每套序列分別用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，黑麥屬5SrDNA單元以無分子鐘(non-clock)模式分化。從最大似然樹上可以看出longR1單元遵循HKY替換模式，而shortR1單元遵循HKY+G替換模型。longR1與longPl的進(jìn)化關(guān)系最近，其次為longJ1；而shortR1與longS1的關(guān)系最近，其次為shortJl，與shortV1的關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。貝葉斯統(tǒng)

9、計(jì)分析也獲得了一致的結(jié)果。 4.利用根據(jù)已知LMW-GS序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物對(duì)黑麥屬各物種基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果在3份S.sylvestre中獲得了目的片段。對(duì)S.sylvestre材料R955/90的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆、測序，共得到3個(gè)基因序列(Ssy1，Ssy2和Ssy3)，Genbank登錄號(hào)分別為AY829368、AY829369和AY829370。Ssy1，Ssy2和Ssy3基因編碼的氨基酸序列均包含4個(gè)區(qū)段：高

10、度保守的20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽區(qū)域、由13個(gè)氨基酸殘基組成的N-端保守區(qū)、由可重復(fù)短肽組成的高度變異的重復(fù)區(qū)和C-端保守區(qū)。由于N-端保守區(qū)第一個(gè)氨基酸均為Met，所以Ssy1，Ssy2和Ssy3均為LMW-m型。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所獲得的3個(gè)LMW谷蛋白類似基因與小麥的LMW-GS基因和大麥的Bhordein基因具較高的一致性。與小麥Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)LMW-GS序列同源關(guān)系比較分析也取得了一致的結(jié)果。