BIG-3基因的克隆、表達及其促成骨活性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、BIG-3在體外加速軟骨細胞的分化和成熟,在小鼠胚胎發(fā)育期BIG-3的表達,表明BIG-3可能是軟骨細胞分化和增生肥大的調節(jié)因子.同時,BIG-3在成骨細胞中表達并能加速成骨細胞的分化,表明BIG-3蛋白參與體內軟骨內骨形成過程.一.該組實驗首先采用生物軟件分析了小鼠和人BIG-3基因全長編碼序列的同源性和序列的一致性.二.使用Genbank檢索BIG-3基因序列,根據引物設計原則設計引物并交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;從新

2、生小鼠顱骨中提取總RNA,經RT-PCR得到全長BIG-3產物;將載體和PCR產物雙酶切,經連接反應后轉化感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,構建原核表達載體并對重組子pGEX-4T-2-BIG-3進行序列測定.結果顯示所得的目的基因的序列與從GenBank中檢索到的序列完全一致.三.重組子pGEX-4T-2-BIG-3轉化BL21菌株后經IPTG誘導在60kDa處出現新生表達帶,與預期分子量相符.用IPTG誘導1L收集細菌,超聲裂菌,離心,棄上

3、清,沉淀用8M尿素變性后梯度稀釋復性,在尿素濃度達2M時使用親和層析柱Sepharose 4B純化表達產物,取電泳樣品行SDS-PAGE,證實得到高純度GST-BIG-3融合蛋白.四.用純化的GST-BIG-3蛋白免疫兔,制備多克隆抗體,用雙向免疫擴散試驗測定多克隆抗體的效價,western bolt鑒定其特異性.結果制備了效價為1:128的多克隆抗體,且具有較高的特異性.五.制備pMSCVpuro-BIG-3質粒,復蘇凍存的PT67細

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