阻抑p53對熱化療損傷腸上皮細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、腹腔內(nèi)惡性腫瘤特別是來源于胃腸道和卵巢的低分化惡性腫瘤，常常由于腫瘤細胞的脫落或者通過淋巴管、血管等形成腹腔腫瘤播散，從而導(dǎo)致術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)，降低腫瘤病人術(shù)后的生存率。腹腔溫?zé)峁嘧⒒?IHCP)是臨床上治療腹腔腫瘤播散的有效措施，它可有效殺滅腹腔播散的腫瘤細胞，提高病人的生存率。但是它同放療、化療一樣，在殺傷腫瘤細胞的同時，對于增生活躍的組織或細胞，如腸上皮細胞、淋巴細胞、造血組織等也會產(chǎn)生毒副作用，因而限制了它們的抗腫瘤效應(yīng)。腹腔溫

2、熱灌注化療對于腸上皮細胞的損傷引起諸如惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)而引起研究者的重視，研究發(fā)現(xiàn)這種損傷通常是p53依賴誘導(dǎo)的腸上皮細胞凋亡所致。因此如何降低腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)的腸上皮細胞凋亡成為減輕其抗腫瘤治療副效應(yīng)的重要措施。有研究報道p53特異性抑制劑PFT-α(PFT-α)通過抑制p53而使小鼠能夠耐受致死劑量的放療，并且不會誘發(fā)新的腫瘤形成。PFT-α通過抑制p53依賴誘導(dǎo)的凋亡，成為治療抗腫瘤副效應(yīng)的手段而受到研究者的關(guān)注。P

3、FT-α是否能夠?qū)峄熣T導(dǎo)的腸上皮細胞損傷具有保護作用以及保護機制如何則成為值得研究的課題之一，從而為通過抑制p53而減輕抗腫瘤副效應(yīng)探索新的治療手段。 目的：一、探討p53特異性抑制劑PFT-α對結(jié)腸上皮細胞增殖以及對熱化療抗腫瘤作用的影響。研究PFT-α對熱化療損傷結(jié)腸上皮細胞后細胞凋亡、細胞周期影響以及調(diào)控細胞周期的機制。 二、研究PFT-α對熱化療損傷結(jié)腸上皮細胞后，p53在亞細胞結(jié)構(gòu)的定位和蛋白表達，以及p5

4、3靶基因Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達變化，探討PFT-α對熱化療損傷結(jié)腸上皮細胞的保護機制。 三、研究PFT-α對腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)大腸癌細胞系DLD1(突變型p53)腹腔播散BALB/c鼠小腸上皮細胞凋亡的影響，同時觀察小腸上皮細胞Bax、Bcl-2、MDM2和p21WAF1/CIP1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的變化，以及細胞色素C(cytochromeC，CytC)在小腸上皮細胞線粒體和細胞質(zhì)中的蛋

5、白表達，探討PFT-α對腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷BALB/c鼠小腸上皮細胞產(chǎn)生保護效應(yīng)的機制。 方法：原代培養(yǎng)采用手術(shù)切除的結(jié)腸粘膜，運用Ⅰ型膠原酶和噬熱菌蛋白酶進行體外人結(jié)腸上皮細胞分離培養(yǎng)。采用MTT法分析不同濃度的PFT-α對結(jié)腸上皮細胞以及熱化療抗腫瘤作用的影響；熱化療以及PFT-α聯(lián)合熱化療作用結(jié)腸上皮細胞后，流式細胞儀檢測細胞周期分布；AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡率。蛋白印跡法(Weste

6、rnblot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測結(jié)腸上皮細胞CyclinB1的蛋白和mRNA表達，Westernblot檢測結(jié)腸上皮細胞的Cdc2(Tyr15)蛋白表達。免疫細胞化學(xué)和Westernblot觀察熱化療以及PFT-α聯(lián)合熱化療對結(jié)腸上皮細胞p53在亞細胞結(jié)構(gòu)的定位、蛋白表達變化。Westernblot檢測結(jié)腸上皮細胞Bax、MDM

7、2和p21WAF1/CIP1在不同處理因素下蛋白含量的變化。RT-PCR檢測結(jié)腸上皮細胞Bax、MDM2和p21WAF1/CIP1mRNA表達水平的變化。運用大腸癌細胞系DLD1(突變型p53)腹腔播散BALB/c鼠模型，TUNEL法觀察了PFT-α對腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)BALB/c鼠小腸上皮細胞凋亡的影響，Westernblot檢測BALB/c鼠小腸上皮細胞Bax、Bcl-2、MDM2、p21WAF1/CIP1以及細胞色素C在小腸上皮

8、細胞線粒體和細胞質(zhì)中的蛋白表達。RT-PCR檢測BALB/c鼠小腸上皮細胞Bax、Bcl-2、MDM2、p21WAF1/CIP1mRNA的表達。 結(jié)果：一、PFT-α的濃度低于50μM時，對結(jié)腸上皮細胞的生長不產(chǎn)生影響，而當(dāng)其濃度達到60μM時，PFT-α可抑制結(jié)腸上皮細胞的生長。當(dāng)濃度達到70μM時，PFT-α對結(jié)腸上皮細胞的生長抑制效應(yīng)更加明顯(P＜0.01)。當(dāng)PFT-α濃度在5μM～40μM之間時，PFT-α對DLD1細

9、胞的生長并不產(chǎn)生任何影響，當(dāng)濃度達50μM時，PFT-α對腫瘤細胞的生長具有一定的抑制效應(yīng)(P＜0.05)，濃度達60μM，則這種抑制效應(yīng)更趨明顯(P＜0.01)，PFT-α自身表現(xiàn)出細胞毒效應(yīng)。當(dāng)PFT-α聯(lián)合熱化療處理DLD1細胞時，PFT-α的濃度低于40μM，對于熱化療殺傷DLD1細胞無增強或減弱效應(yīng)，而當(dāng)濃度達到50μM和60μM，PFT-α可以增強熱化療對于DLD1細胞的殺傷效應(yīng)，表現(xiàn)出細胞毒副作用的疊加效應(yīng)。 二、

10、在熱化療損傷后，結(jié)腸上皮細胞的凋亡率升高，凋亡率顯著高于正常對照組(P＜0.01)。PFT-α聯(lián)合熱化療處理結(jié)腸上皮細胞后，細胞的凋亡率逐漸下降，細胞停滯于G2/M期，與熱化療組比較凋亡率顯著下降，G2/M期顯著延長(P＜0.01)，呈濃度依賴性。同時CyclinB1蛋白、mRNA表達水平以及Cdc2(Tyr15)蛋白表達隨PFT-α濃度增大而逐漸升高。PFT-α抑制熱化療誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細胞p53核轉(zhuǎn)位，降低熱化療誘導(dǎo)的p53在細胞核中

11、的蛋白表達水平，隨PFT-α濃度增大，結(jié)腸上皮細胞Bax、MDM2、和p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達逐漸降低。 三、隨PFT-α劑量增加，PFT-α對腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)的BALB/c鼠小腸上皮細胞凋亡的抑制作用逐漸增強，凋亡指數(shù)顯著低于腹腔溫?zé)峁嘧⒒熃M(P＜0.01)。Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達水平逐漸降低，而Bcl-2蛋白和mRNA表達則上升。PFT-α抑制腹腔溫?zé)峁嘧⒒煂?dǎo)致

12、的BALB/c鼠小腸上皮細胞線粒體細胞色素C蛋白向細胞質(zhì)的釋放，使細胞質(zhì)中細胞色素C蛋白表達水平隨PFT-α劑量的升高而降低。 結(jié)論：一、PFT-α在低于50μM時對結(jié)腸上皮細胞增殖無任何影響，高于60μM則對該細胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。PFT-α在低于40μM時對于熱化療抗腫瘤作用無影響，高于50μM時則與熱化療具有協(xié)同效應(yīng)，增強熱化療的抗腫瘤作用。 二、PFT-α對于熱化療導(dǎo)致的結(jié)腸上皮細胞損傷具有保護作用，通過抑制熱

13、化療誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞的凋亡，保護效應(yīng)呈濃度依賴性增強。PFT-α通過增強CyclinB1蛋白和mRNA的表達水平，同時Cdc2(Tyr15)磷酸化水平升高，降低CyclinB1/Cdc2的活性，使細胞停滯于G2/M期。PFT-α抑制p53的核轉(zhuǎn)位，使p53主要位于細胞質(zhì)中，同時在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平抑制p53靶基因Bax、MDM2和p21WAF1/CIP1的表達，從而降低熱化療導(dǎo)致的結(jié)腸上皮細胞凋亡，發(fā)揮保護結(jié)腸上皮細胞的作用。 三、

14、PFT-α作用于腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷DLD1腹腔播散BALB/c鼠小腸上皮細胞后，其小腸上皮細胞的凋亡顯著降低。Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1的蛋白和mRNA表達水平降低，Bcl-2蛋白和mRNA表達增強。同時降低細胞色素C從BALB/c鼠小腸上皮細胞線粒體向細胞質(zhì)中的釋放。因此PFT-α可使BALB/c鼠小腸上皮細胞免受腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷，其保護效應(yīng)機制是PFT-α不僅通過調(diào)控凋亡基因和促凋亡基因的表達，而且調(diào)控細胞色素