淋球菌NspA核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫活性的初步研究.pdf

1、目的:根據(jù)GenBank登錄的淋球菌WHO-A株的NspA核酸序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出NspA基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NspA,直接肌注免疫BALB/c小鼠,觀(guān)察其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,為研制新型、高效的淋球菌核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增NspA全基因;將PCR產(chǎn)物純化后與pUCm-T載體相連,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后,亞克隆至pcD

2、NA3.1(+)真核表達(dá)載體中;陽(yáng)性克隆經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染RAW264.7和COS-7細(xì)胞,用RT-PCR檢測(cè)NspA mRNA的水平,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)。以pcDNA3.1(+)/NspA肌注免疫6w齡BALB/c小鼠,試管凝集法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗NspA抗體水平,ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平, MTT比色法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),PCR檢測(cè)淋球菌NspA基因在小鼠股四頭肌的存在。

3、>　　結(jié)果:成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/NspA真核表達(dá)載體,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RAW264.7和COS-7細(xì)胞后,用RT-PCR檢測(cè)NspA mRNA的水平,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá),表明重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞有效轉(zhuǎn)錄和表達(dá) NspA。小鼠接種pcDNA3.1(+)/NspA核酸疫苗后,能產(chǎn)生抗NspA的特異性抗體,其滴度隨著時(shí)間的增加和加強(qiáng)免疫而增高,6w后抗體最高滴度達(dá)1:640。核酸疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后,培養(yǎng)上

4、清中IFN-γ含量明顯升高(169.71±30.52pg/mL),與空質(zhì)粒組(23.79±11.85pg/mL)和PBS組(8.71±2.50pg/mL)之間有顯著性差異(P<0.01)。脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定,未加 PHA時(shí),T淋巴細(xì)胞呈單個(gè)分布,無(wú)細(xì)胞增殖;加入 PHA后,核酸疫苗組細(xì)胞增殖明顯活躍,細(xì)胞成團(tuán)增長(zhǎng),而對(duì)照組細(xì)胞增殖不旺盛,少見(jiàn)成團(tuán)增長(zhǎng)細(xì)胞,說(shuō)明核酸疫苗免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刺激反應(yīng)和增殖活性增強(qiáng)。核酸疫苗組小鼠

5、脾淋巴細(xì)胞經(jīng) PHA刺激后刺激指數(shù)(1.97±0.74)明顯高于空質(zhì)粒組(1.05±0.30)和PBS組(1.02±0.20)(P<0.01)。PCR檢測(cè)NspA基因可在小鼠肌細(xì)胞中存在。
　　結(jié)論:
　　(1)正確克隆了淋球菌NspA基因,并構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/NspA真核表達(dá)載體。
　　(2)pcDNA3.1(+)/NspA真核表達(dá)載體能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
　　(3)pcDNA3.1(+)/NspA