脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔絲素材料修復(fù)尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 建立兔尿道缺損模型，探索脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔絲素材料修復(fù)尿道缺損的可行性。 方法： 1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)分離、培養(yǎng)和純化： 取兔附睪旁脂肪組織，0.15％Ⅰ型膠原酶消化分離、培養(yǎng)ADMSCs細(xì)胞，MTT法測(cè)定第3代ADMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，熒光免疫法測(cè)定CD44單克隆抗體、Vimentin單克隆抗體。 2.應(yīng)用復(fù)合ADMSCs的多孔絲素材料修復(fù)尿道缺損實(shí)驗(yàn)： 選

2、取39只體重約3.0-4.5kg雄性新西蘭大白兔，隨機(jī)分3組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：(1)對(duì)照組(n=13)，(2)多孔絲素材料組(SF組，n=13)，(3) BrdU標(biāo)記的ADMSCs+多孔絲素材料組(SSF組，n=13)。常規(guī)麻醉后于尿道腹側(cè)正中線縱行切開(kāi)尿道前壁1.5cm，切除2.5×1.0c㎡尿道后壁，建立尿道缺損模型。對(duì)照組切除尿道后壁，縫合尿道前壁，術(shù)后留置導(dǎo)尿3w。SF組切除尿道后壁，將多孔絲素材料用Inlay術(shù)式修復(fù)尿道缺損后，縫

3、合尿道前壁，術(shù)后留置導(dǎo)尿3w。SSF組切除尿道后壁后，將復(fù)合BrdU標(biāo)記ADMSCs細(xì)胞的多孔絲素材料用Inlay術(shù)式修復(fù)尿道缺損后，縫合尿道前壁，術(shù)后留置導(dǎo)尿3w。各組動(dòng)物術(shù)后導(dǎo)尿管每天用呋喃西林沖洗一次。術(shù)后分批處死動(dòng)物，收集手術(shù)區(qū)尿道標(biāo)本行HE染色常規(guī)病理檢查，免疫組織化學(xué)測(cè)定FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3陽(yáng)性細(xì)胞，觀察BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(SSF組)、巨噬細(xì)胞分布情況。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)前和處死前均行尿道造影檢查。

4、主要結(jié)果： 1.ADMSCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化： 分離培養(yǎng)2h后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁。ADMSCs細(xì)胞3d后多呈梭形成纖維細(xì)胞樣，培養(yǎng)5-7d后，細(xì)胞生長(zhǎng)可達(dá)80％～90％融合，進(jìn)行傳代；第3代ADMSCs細(xì)胞形態(tài)呈均一的長(zhǎng)梭形。常規(guī)培養(yǎng)的第3代ADMSCs細(xì)胞MTT曲線示第1、2d為緩慢生長(zhǎng)期，3d進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期，11d進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。CD44、Vimentin呈陽(yáng)性表達(dá)。 2.應(yīng)用復(fù)合ADMSCs的多孔絲素材料

5、修復(fù)尿道缺損實(shí)驗(yàn)： 2.1尿道造影： 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前逆行尿道造影顯示尿道形態(tài)正常，術(shù)后終止實(shí)驗(yàn)前復(fù)查逆行尿道造影觀察尿道狹窄和尿瘺的發(fā)生情況。對(duì)照組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率為76.92％(7/13)，高于SF組的23.07％(3/13)和SSF組的15.38％(2/13)，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。SSF組和SF組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2.2大體形態(tài)學(xué)觀察： 肉眼觀察，

6、對(duì)照組術(shù)后2w尿道缺損區(qū)缺乏內(nèi)襯黏膜，表面凹凸不平，周圍尿道黏膜充血、水腫，術(shù)后4w、6w瘢痕已經(jīng)形成，黏膜收縮，管腔狹窄。SSF組和SF組術(shù)后2w手術(shù)區(qū)絲素材料仍裸露在尿道管腔內(nèi)側(cè)表面，缺乏內(nèi)襯黏膜。術(shù)后4w、6w絲素表面覆蓋黏膜，少量絲素脫落。 組織學(xué)觀察：對(duì)照組術(shù)后2w尿道缺損區(qū)尿道黏膜上皮未形成，可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后4w缺損區(qū)尿道黏膜形成不連續(xù)，表面高低不平，黏膜下可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生。術(shù)后6w缺損

7、區(qū)尿道黏膜上皮細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)胞排列不規(guī)則，極性紊亂。黏膜下仍可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)散在少量平滑肌纖維。 SF組術(shù)后2w多孔絲素表面沒(méi)有上皮細(xì)胞形成，在多孔絲素基底部少量血管、膠原纖維組織生長(zhǎng)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)降解。術(shù)后4w在多孔絲素表面形成復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，黏膜下可見(jiàn)血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長(zhǎng)，絲素中部分組織生長(zhǎng)不完全，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)降解。術(shù)后

8、6w在多孔絲素表面形成3-4層上皮細(xì)胞，黏膜下可見(jiàn)較多血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長(zhǎng)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯降解。 SSF組術(shù)后2w多孔絲素表面沒(méi)有上皮細(xì)胞形成，在多孔絲素基底部較多的血管、膠原纖維組織生長(zhǎng)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)降解。術(shù)后4w在多孔絲素表面形成3-4層上皮細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)則，黏膜下可見(jiàn)大量血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長(zhǎng)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯

9、降解。術(shù)后6w在多孔絲素表面形6-7層上皮細(xì)胞，排列規(guī)則。黏膜下可見(jiàn)大量的血管、平滑肌、纖維組織沿著絲素孔隙生長(zhǎng)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，絲素被分解成小塊狀。 2.3巨噬細(xì)胞和Brdu、FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3陽(yáng)性細(xì)胞分布情況： 術(shù)后2、4、6w于SSF組和SF組絲素間隙和邊緣可見(jiàn)巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，術(shù)后4w于SSF組巨噬細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)分別為11.66±1.58/HP，較同時(shí)間點(diǎn)SF組(13.88±2.08/HP)明

10、顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05) 術(shù)后2、4、6w于SSF組絲素材料中可見(jiàn)散在的Brdu陽(yáng)性的細(xì)胞，在絲素材料與尿道相交處較多。 術(shù)后2、4、6w于SSF組、SF組、對(duì)照組尿道手術(shù)缺損區(qū)均可見(jiàn)FⅧ-RAg細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后4w于SSF組、SF組FⅧ-RAg陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為23.44±2.40/HP、20.77±2.38/HP，較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(15.11±1.61/HP)明顯增多，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)；

11、同時(shí)SSF組較SF組明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 術(shù)后2、4、6w于SSF組、SF組、對(duì)照組尿道手術(shù)缺損區(qū)均可見(jiàn)α-SMA細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后4w于SSF組、SF組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為33.00±3.27/HP、29.00±3.20/HP，較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(16.11±1.53/HP)明顯增多，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；同時(shí)SSF組較SF組明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05) SSF組與SF組