酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和細(xì)胞組分)參與的氣道慢性炎癥性疾病。其中，Th1和Th2淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目和(或)功能失衡，以及Th1/Th2比例失調(diào)，在哮喘發(fā)病中起重要作用；而Treg細(xì)胞能以“主動(dòng)“方式來(lái)維持機(jī)體的免疫平衡；糾正這種失衡的免疫學(xué)反應(yīng)是控制哮喘發(fā)作的一個(gè)重要研究方向。 幾丁質(zhì)微粒(CMP)是指直徑1～20μm幾丁質(zhì)顆粒，研究顯示它可降低哮喘小鼠氣道炎癥，增加

2、IFN-γ的表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)，酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶(AMCase)的表達(dá)與支氣管哮喘密切相關(guān)，能有效影響TH2炎癥因子表達(dá)，但其不影響IL-4、IL-5、IL-13、IFN-Y以及STAT-6的表達(dá)。由于動(dòng)物研究顯示幾丁質(zhì)酶常在致敏原刺激7天后明顯表達(dá)，提示幾丁質(zhì)酶與氣道重塑可能有關(guān)，AMCase在支氣管哮喘病理生理機(jī)制中起到不可忽略的作用。 已知，哺乳動(dòng)物體內(nèi)不存在幾丁質(zhì)合成酶，但酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶的發(fā)現(xiàn)，有理由引起研究者

3、對(duì)幾丁質(zhì)和酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶對(duì)哺乳動(dòng)物作用相互關(guān)系的興趣；兩者對(duì)支氣管哮喘病理生理機(jī)制如何影響?以及如何相互影響?有待進(jìn)一步研究。 第一部分幾丁質(zhì)微粒對(duì)支氣管哮喘小鼠TH2型趨化因子、TGF-β1、AMCase表達(dá)的影響 目的:觀察幾丁質(zhì)微粒對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、TH2型趨化因子及TGF-β1、AMCase表達(dá)的影響。 方法: BALB/C小鼠分為四組，分別為哮喘組、對(duì)照組、經(jīng)口幾丁質(zhì)組、經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組。哮喘

4、組、兩幾丁質(zhì)干預(yù)組(CMP 40gg)經(jīng)卵清蛋白致敏14天后，最后一次OVA霧化結(jié)束后24h，收集BALF進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，測(cè)定BALF中IL-10和TGF-β1；流式細(xì)胞檢測(cè)Th1、Th2、Treg比例；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測(cè)肺組織TGF-β1的表達(dá)；原位雜交方法檢測(cè)肺組織AMCase mRNA；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量測(cè)定肺組織內(nèi)TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、

5、STAT1和C-jun mRNA表達(dá)。 結(jié)果:各幾丁質(zhì)組較哮喘組小鼠氣道炎癥明顯減輕，BALF嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少。幾丁質(zhì)組Th1淋巴細(xì)胞比例較哮喘組明顯增高，TGF-β1的表達(dá)、小鼠肺組織AMCase、STAT1mRNA的表達(dá)明顯降低。經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組TARC mRNA的表達(dá)較哮喘組和對(duì)照組明顯增高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)經(jīng)口幾丁質(zhì)組MDCmRNA表達(dá)較哮喘組明顯增高，但經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組MDC mRNA的表達(dá)較哮喘組明顯

6、減低。經(jīng)口幾丁質(zhì)組NF-κB、C-jun mRNA的表達(dá)較哮喘組明顯增高。 結(jié)論:幾丁質(zhì)微粒可通過(guò)提高Th1細(xì)胞比例在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，降低肺組織TGF-β1、STAT1和AMCase mRNA的表達(dá)。幾丁質(zhì)微?？纱龠M(jìn)肺組織TARC、NF-κB、C-jun mRNA的表達(dá)。 第二部分幾丁質(zhì)酶抑制劑對(duì)支氣管哮喘小鼠TH2型趨化因子、TGF-β1表達(dá)的影響 目的:觀察幾丁質(zhì)酶抑制劑對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道

7、炎癥、TH2型趨化因子及TGF-β1表達(dá)的影響。 方法:BALB/C小鼠分為三組，分別為哮喘組、對(duì)照組和抑制劑組。哮喘組、抑制劑組(0.5mg/kg)經(jīng)卵清蛋白致敏14天后，最后一次OVA霧化結(jié)束后24h，收集BALF進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，測(cè)定BALF中IL-10和TGF-β1；流式細(xì)胞檢測(cè)Th1、Th2、Treg比例；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測(cè)肺組織TGF-β1的表達(dá)；原位雜交方法檢測(cè)肺組織AMCase m

8、RNA；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量測(cè)定肺組織內(nèi)TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、STAT1和C-jun mRNA表達(dá)。 結(jié)果:幾丁質(zhì)酶抑制劑組較哮喘組小鼠氣道炎癥明顯減輕，BALF中嗜酸性粒細(xì)胞明顯減少，TGF-β1、STAT1 mRNA的表達(dá)顯著降低；BALF中IL-10水平和脾單核細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例明顯提高，C-jun mRNA的表達(dá)增加。 結(jié)論:幾丁質(zhì)酶抑制劑可促進(jìn)Tre

9、g細(xì)胞表達(dá)，降低肺組織TGF-β1和STAT1 mRNA的表達(dá)，提高肺組織C-jun mRNA的表達(dá)，在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。 第三部分酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶mRNA表達(dá)及其影響因素探討 目的:觀察人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶(AMCase)表達(dá)特點(diǎn)，及幾丁質(zhì)微粒(CMP)和布地奈德的影響。 方法:HBE細(xì)胞分別與細(xì)胞因子共同孵育2、4、8、16、24，48和72小時(shí)。HBE細(xì)胞分別與

10、細(xì)胞因子和干預(yù)劑CMP、布地奈德共同孵育24小時(shí)。用Realtime PCR方法測(cè)定HBE細(xì)胞AMCase mRNA表達(dá)； 結(jié)果:IL-13刺激HBE 24小時(shí)AMCase mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。IL-4刺激HBEAMCase mRNA表達(dá)呈波浪樣變化，在48h表達(dá)為一高峰，在2h存在一小峰值，但于刺激后72小時(shí)，AMCase mRNA的表達(dá)卻明顯降低，幾乎接近刺激前的基因表達(dá)水平。TNF-α、Der P1、IL-13+De

11、r P1和IL-4+Der P1刺激對(duì)HBE AMCase mRNA表達(dá)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)逐漸升高；Der P1在刺激4h，IL-4+Der P1在刺激2h表達(dá)有一峰值。CMP可促進(jìn)IL-13+Der P1和IL-4+Der P1誘導(dǎo)HBE表達(dá)AMCasemRNA，該作用可被布地奈德逆轉(zhuǎn)，又可降低HBE AMCase mRNA表達(dá)。 結(jié)論:IL-4、TNF-α、Der P1和CMP可直接作用于支氣管上皮細(xì)胞促進(jìn)AMCase

12、mRNA。糖皮質(zhì)激素可降低AMCase mRNA表達(dá)。 第四部分AMCase對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞TARC、TGF-β1、ICAM-1mRNA表達(dá)的影響 目的:觀察人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)AMCase對(duì)TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響。 方法:應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，HBE和RNAiHBE細(xì)胞分別與細(xì)胞因子共同孵育24小時(shí)，觀察AMCase干擾前后TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表