梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸胰蛋白酶活性、表達(dá)量及與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系研究.pdf

1、梨小食心蟲(chóng)Grapholitha molesta是一種世界性果樹(shù)重要害蟲(chóng)，主要危害桃梢及桃、梨、蘋(píng)果等果實(shí)，其典型的季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害習(xí)性是引起梨小食心蟲(chóng)常年猖獗成災(zāi)的主要原因。昆蟲(chóng)中腸胰蛋白酶在昆蟲(chóng)取食消化和生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。本研究以梨小食心蟲(chóng)為研究對(duì)象，首先運(yùn)用生化技術(shù)測(cè)定了梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸蛋白酶的最適pH。在此基礎(chǔ)上，一方面用不同寄主植物飼喂梨小食心蟲(chóng)，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育狀況，同時(shí)測(cè)定胰蛋白酶的活性，初步探明胰蛋白酶的活性在昆

2、蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及寄主適應(yīng)性。另一方面運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆中腸胰蛋白酶基因，獲得其序列相關(guān)生物學(xué)信息，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定其在取食不同寄主植物的梨小食心蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)量，初步明確胰蛋白酶在昆蟲(chóng)消化過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，為以昆蟲(chóng)中腸蛋白酶為靶標(biāo)的害蟲(chóng)防治提供新思路。取得的具體研究結(jié)果如下:
　　(1)運(yùn)用生化技術(shù)獲得在Tris-HCl，KH2PO4/NaOH和Glycine/NaOH3種緩沖液中，梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸總蛋白

3、酶最適pH分別為10.5、11.0和11.0，強(qiáng)堿性胰蛋白酶的最適pH分別為10.5、11.0和11.0，弱堿性胰蛋白酶的最適pH分別為8.5、9.0和9.0。
　　(2)收集從田間采集到的桃梢、梨、木瓜、蘋(píng)果（秦冠）4種寄主植物和人工飼料飼養(yǎng)的蟲(chóng)源取食蘋(píng)果（秦冠）、蘋(píng)果（嘎啦）、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實(shí)的梨小食心蟲(chóng)不同齡期幼蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)其中腸總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶活性存在差異顯著。
　　從田間4種寄主

4、植物上采集到的梨小食心蟲(chóng)中腸3種蛋白酶活性均表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡，其中從寄主梨上采集的梨小食心蟲(chóng)3種蛋白酶活性最高，其次為木瓜。
　　室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食6種不同寄主，其總蛋白酶活性在4齡差異顯著;強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性差異顯著，活性表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡;弱堿性胰蛋白酶活性無(wú)差異。
　　室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠）的總蛋白酶和強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性大于取食蘋(píng)果（嘎啦）的活性。從田間寄主蘋(píng)果（秦冠）上采

5、集的梨小食心蟲(chóng)總蛋白酶和強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性小于用人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠）寄主的活性。
　　(3)室內(nèi)觀察人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠）、蘋(píng)果（嘎啦）、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實(shí)及從田間寄主蘋(píng)果（秦冠）上采集梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠）的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖狀況，發(fā)現(xiàn)其在不同寄主植物間存在顯著性差異。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食毛桃，其幼蟲(chóng)期(9.79 d)、成蟲(chóng)期(11.16 d)、幼蟲(chóng)-成蟲(chóng)總歷期(29.09 d)、

6、幼蟲(chóng)存活率(38.66％)、羽化率(68.86％)、產(chǎn)卵量（50.0粒）和蛹重(8.96 mg)都比較低，但內(nèi)稟增長(zhǎng)率rm較大;取食寄主蘋(píng)果（秦冠）的梨小食心蟲(chóng)的化蛹率(98.13％)和單雌產(chǎn)卵量（67.8粒）大于取食寄主蘋(píng)果（嘎啦）;取食寄主李的梨小食心蟲(chóng)的單雌產(chǎn)卵量（110.6粒）最高;取食寄主蘋(píng)果的單雌產(chǎn)卵量高于取食桃果。李是梨小食心蟲(chóng)最適宜的寄主。
　　(4)利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆出GMtrypsin-1與GMtrypsi

7、n-2兩個(gè)梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸胰蛋白酶基因，其長(zhǎng)度分別為861 bp和923bp，分別編碼257和259個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量分別為27.98 kDa和27.93 kDa。氨基酸序列分析表明2個(gè)基因翻譯出的蛋白均含信號(hào)肽、催化三聯(lián)體His-Asp-Ser以及末端高度保守區(qū)RIVGG和GDSGGP，這些結(jié)構(gòu)與胰蛋白酶所具有的特征一致。氨基酸序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)基因G Mtrypsin-1與大豆食心蟲(chóng)Leguminivora glyciniv

8、orella的親緣關(guān)系較近，而基因GMtrypsin-2與其它鱗翅目昆蟲(chóng)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸內(nèi)胰蛋白酶基因G Mtrypsin-1與GMtrypsin-2在取食不同寄主的梨小食心蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)量存在顯著差異。在4齡時(shí)的表達(dá)量＞3齡＞5齡。從田間寄主蘋(píng)果（秦冠）上采集梨小食心蟲(chóng)的Mtrypsin-1表達(dá)量高于人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠），而GMtrypsin-2表達(dá)量低

9、于后者。人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲(chóng)取食蘋(píng)果（秦冠），其2個(gè)基因的表達(dá)量均低于取食蘋(píng)果（嘎啦）。從田間寄主桃樹(shù)梢上采集的梨小食心蟲(chóng)、人工飼料飼養(yǎng)取食蘋(píng)果（嘎啦）和油桃的梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)，2個(gè)基因的表達(dá)量都較高。
　　(6)綜合分析表明:胰蛋白酶活性影響梨小食心蟲(chóng)歷期、蛹重、羽化率及產(chǎn)卵量等參數(shù)，促進(jìn)梨小食心蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。梨小食心蟲(chóng)中腸蛋白酶活性和胰蛋白酶基因表達(dá)量均表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)取食寄主李的GMtrypsin