磷酸化15位點絲氨酸對Hsf4b轉錄活性的調控作用.pdf

1、背景:先天性白內障是導致兒童失明的主要原因,大約0.3-1.5/1000的兒童患有先天性白內障,其主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩、晶狀體內非透明瘢塊組織形成。染色體異常為先天性白內障的主要致病原因,大量研究證據(jù)表明,轉錄因子基因突變和功能缺陷是誘發(fā)先天性白內障的遺傳病因之一,如Pax6、FoxE3、Six3、Prox1、Sox2/3、Maf、Pitx3、AP-2a和Hsf4。在正常情況下,這些轉錄因子的瞬時激活和滅活決定晶狀體不同發(fā)育階段

2、,如Pax6在胚胎早期neuronal ectodem的表面細胞內被激活,促使外胚層上皮細胞形成晶狀體placode和晶狀體vesicle結構、誘導上皮細胞向初級纖維細胞分化、調控δ-crystallin和alpha A-crystallin等多種蛋白的表達。出生后隨著晶狀體的成熟,Pax6轉錄活性被抑制。Pax6基因突變與臨床先天遺傳性白內障的發(fā)生密切相關。熱休克轉錄因子4(Hsf4)是調控新生兒期晶狀體發(fā)育的關鍵轉錄因子。正常情況下

3、,Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶狀體組織內開始表達,在新生兒期(P1-P28)達到高峰,隨著晶狀體成熟而逐漸減少。Hsf4 DNA結合域密碼錯義突變(如L115P、I87V、A20D和H74R)與中國和丹麥家族常染色體顯性遺傳性lamellar型白內障,以及中國家族性顯性遺傳性總白內障( total white cataract)的發(fā)生密切相關。敲除小鼠Hsf4基因可誘發(fā)新生期小鼠先天性白內障,主要病理改變?yōu)榫铙w前囊上皮非正常增生、纖

4、維細胞內變性蛋白堆積和纖維細胞終末分化障礙。因此認為Hsf4轉錄活性對維持新生兒期晶狀體正常發(fā)育至關重要。
　　Hsf4是熱休克轉錄因子家族成員之一,在機體內有兩種亞型Hsf4a和Hsf4b.它們來源于同一個基因的不同mRNA剪輯過程。Hsf4a和Hsf4b因結構不同造成其轉錄活性相反。Hsf4a為轉錄抑制子,而Hsf4b則為轉錄激活子。晶狀體中只有Hsf4b這一種活性形式。它主要參與調控小分子熱休克蛋白(Hsp25, r-crs

5、tallin, a-crystallin和纖維細胞骨架蛋白(imentin,filesin)等蛋白的表達。其轉錄活性受磷酸化調控。但是磷酸化調控Hsf4轉錄活性的機理和相關信號通路不清楚。探討Hsf4b磷酸化調控機理對揭示Hsf4轉錄功能障礙而誘發(fā)先天白內障的機理具有重要意義。我們應用丙氨酸定點突變技術,將Hsf4b分子中的高危磷酸化位點做突變掃描,結果發(fā)現(xiàn)Hsf4b DNA結合域的15位點絲氨酸突變對Hsf4b轉錄活性有明顯的抑制作用

6、。本課題通過構建Hsf4b DNA結合域15位點突變表達載體,構建其在小鼠晶狀體上皮細胞中穩(wěn)定表達的細胞株,并通過一系列實驗,集中探討了S15位點磷酸化對Hsf4b轉錄活性的調控機理。
　　目的:通過突變S15A位點研究磷酸化S15位點對Hsf4b轉錄活性的調控機理。
　　方法:
　　1.根據(jù)Genebank中小鼠的Hsf4b基因序列,按照設計引物的要求,使用primer premier5引物設計軟件及GPS2.1磷酸

7、化位點檢測軟件,設計S15位點突變引物:(Primer S15上游引物: GAG CCA GGC CCC GCC CCC GTG CCT GCC Primer S15下游引物:GGC AGG CAC GGG GGC GGG GCC TGG CTC)通過基因擴增技術突變Hsf4b DNA結合域15位點,構建突變體載體——pWZL-HA-Hsf4b-S15A,酶切及測序鑒定突變位點。
　　2.將表達野生Hsf4b和突變Hsf4b/S1

8、5A的逆轉錄病毒感染小鼠晶狀體上皮細胞(mLEC/Hsf4-/-),用blasticidin篩選成功構建穩(wěn)定株。
　　3.通過western-blotting驗證該位點的突變影響了其下游蛋白的表達。
　　4.設計luciferase熒光素酶實驗檢測Hsf4b和Hsf4b/S15A突變體對αB-晶體蛋白(alpha B-crystallin)基因啟動子的調控。
　　結果:
　　1.通過基因擴增技術將Hsf4b DN

9、A結合域15位點突變,構建pWZL-HA-Hsf4b-S15A突變體載體。構建其在小鼠晶狀體上皮細胞(mLEC)中穩(wěn)定表達的細胞株。
　　2.與野生Hsf4b相比,Hsf4b-S15A突變可明顯抑制下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin、alpha A-crystallin的表達。
　　3.15位點突變后的Hsf4b能抑制alpha B-crystallin基因啟動子的轉錄。
　　結論:Hsf4bS1