表面展示豬不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒疫苗載體研究.pdf

1、與其他的病毒載體系統(tǒng)比較，桿狀病毒用于基因轉(zhuǎn)移和疫苗遞送擁有顯著的優(yōu)勢(shì)，如插入外源片段容量大、操作簡(jiǎn)單、生物安全性高（不具有整合性和哺乳動(dòng)物致病性）以及哺乳動(dòng)物中不存在針對(duì)桿狀病毒的先天免疫。攜帶哺乳動(dòng)物病毒活性啟動(dòng)子的重組桿狀病毒（BacMam virus）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因而被廣泛研究。
　　然而，桿狀病毒用于哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移仍面臨兩大瓶頸:哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的清除和哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，尤其是針對(duì)樹突細(xì)胞(DCs)、

2、巨噬細(xì)胞(MΦ)、B細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞表現(xiàn)出極低的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這在一定程度上限制了桿狀病毒載體疫苗的效力。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，表面展示豬IgG1 Fc可通過(guò)增強(qiáng)桿狀病毒補(bǔ)體逃逸和轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞從而提高桿狀病毒載體疫苗的效力。IgG Fc在體內(nèi)主要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(FcRn)、補(bǔ)體途徑(C1q)和免疫細(xì)胞識(shí)別途徑（FcγRI）來(lái)調(diào)控誘導(dǎo)免疫反應(yīng)?？紤]到豬不同亞型IgG Fc在結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，在與上述三種途徑識(shí)別受體的結(jié)合能力方面也存

3、在差異。本研究通過(guò)嘗試構(gòu)建表面展示不同亞型IgG Fc的桿狀病毒，探究不同亞型IgG Fc是否具有類似IgG1 Fc的功能，并篩選更具佐劑潛力的IgG Fc亞型，為構(gòu)建高效的拮抗補(bǔ)體重組桿狀病毒疫苗載體提供理論支持和技術(shù)手段。本研究取得了以下結(jié)果:
　　1.重組桿狀病毒的構(gòu)建和鑒定
　　本試驗(yàn)基于MultiBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)在載體pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED多克隆位點(diǎn)中插入不同亞型IgG Fc構(gòu)建

4、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞包裝重組桿狀病毒。Western blot和間接免疫熒光分析顯示目的基因正確正確表達(dá)并定位在重組桿狀病毒表面。這些結(jié)果表明，成功構(gòu)建了8種展示不同亞型IgGFc的VSV-G假型化的重組桿狀病毒。
　　2.重組桿狀病毒的豬血清補(bǔ)體系統(tǒng)拮抗能力和體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)評(píng)價(jià)
　　通過(guò)體外試驗(yàn)比較展示不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒在豬血清中的存活率，與對(duì)照病毒BV-vsvg相比(16

5、.59％)，展示豬不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒存活率均顯著提高，其中BV-vsvg-pFc2(52％)最高，其次是BV-vsvg-pFc3(49.39％)和BV-vsvg-pFc(47.2％)。而展示人IgG1 Fc的重組病毒（BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc）存活率(17.04％～23.9％)與對(duì)照病毒沒有顯著差異。轉(zhuǎn)導(dǎo)IEC細(xì)胞后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)結(jié)果顯示，展示豬IgG Fc不同亞型的重組桿狀病毒在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因表

6、達(dá)上較對(duì)照病毒均有顯著增強(qiáng)，其中BV-vsvg-pFc3最高，其次是BV-vsvg-rpFc3、BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。而由于種屬性差異，展示人IgG1 Fc的重組桿狀病毒BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc在轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平上與對(duì)照病毒BV-vsvg均無(wú)顯著差異。
　　3.展示Fc重組桿狀病毒與Fc激活型受體FcγRI結(jié)合能力比較
　　通過(guò)構(gòu)建FcγRI表達(dá)載體，成功表達(dá)和純化了豬IgG

7、 Fc激活型受體FcγRI。選取在補(bǔ)體逃逸和轉(zhuǎn)基因表達(dá)兩個(gè)方面都有良好表現(xiàn)的3株重組桿狀病毒，以重組FcγRI作為包被物，通過(guò)ELISA分析比較其與FcγRI的結(jié)合能力，其中BV-vsvg-pFc3與FcγRI結(jié)合能力最強(qiáng)，其次是BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。
　　綜上，本研究構(gòu)建了8種展示不同亞型IgG Fc的重組桿狀病毒，補(bǔ)體拮抗能力、體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)和與激活型受體FcγRI結(jié)合活性三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)顯示，表面展示