CD151基因轉(zhuǎn)移對血管內(nèi)皮細胞整合素α3β1-α6β1表達的影響.pdf

1、目的：構建CD151囊泡運輸基序缺陷的ARSA突變體(pAAV-CD151-ARSA 245-248突變體)，包裝病毒，并轉(zhuǎn)染HUVECs細胞，研究CD151對內(nèi)皮細胞整合素表達的影響及CD151促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移的機制。
　　 方法：1. 以pAAV-CD151質(zhì)粒為模板，采用定點突變技術，構建CD151囊泡運輸基序缺陷的ARSA突變體(pAAV-CD151-ARSA 245-248突變體)，并通過基因序列測序鑒定；

2、>　　 2.通過PCR技術擴增質(zhì)粒，并提取質(zhì)粒，用聚乙二醇純化法純化質(zhì)粒；
　　 3.用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法包裝重組腺相關病毒(GFP、CD151基因及其突變體的)，通過斑點雜交檢測重組腺相關病毒滴度；
　　 4.原代培養(yǎng)HUVECs細胞，經(jīng)倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學的鑒定，經(jīng)通過免疫熒光法檢測Ⅷ因子相關抗原；
　　 5. HUVECs細胞分組：①Control組(空白對照組)；②GFP組；③CD151組；④ CD15

3、1-ARSA組。用rAAV-GFP、rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARSA轉(zhuǎn)染HUVECs細胞，進行以下實驗：
　　 5.1 經(jīng)Western blot檢測CD151蛋白質(zhì)的表達時間梯度，觀察轉(zhuǎn)染后細胞CD151表達水平的變化；
　　 5.2 SRB染色測定細胞增殖能力，Boyden小室法測定細胞的遷移能力；
　　 5.3檢測HUVECs細胞整合素a3b1/a6b1的表達水平的變化：
　　

4、5.3.1 經(jīng)Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞a3b1/a6b1表達水平的變化；
　　 5.3.2 應用可還原的細胞表面生物素(NHS-SS-Biotin)標記方法研究CD151在整合素b1內(nèi)化中的作用。
　　 結果：經(jīng)過雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳及基因序列測序鑒定，成功構建了CD151-ARSA突變體；通過斑點雜交檢測證實成功包裝的重組腺相關病毒滴度符合本實驗要求；用rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARS

5、A基因轉(zhuǎn)染HUVECs細胞后，Western blot檢測四組CD151的表達水平CD151與參照β-actin表達條帶相對吸光度值依次為：0.56±0.17、0.52±0.11、1.07±0.12和1.05±0.21，表明rAAV-CD151和rAAV-CD151-ARSA基因轉(zhuǎn)染均可使HUVECs細胞中CD151蛋白質(zhì)表達明顯增加(*P<0.05)；在細胞增殖能力研究中，結果發(fā)現(xiàn)CD151能夠促進細胞的增殖，CD151組(0.552

6、8±0.0064)與Control組(0.2502±0.0039)和GFP組(0.2471±0.0094)比較細胞增殖能力明顯增強，有顯著性差異(*P<0.05)；而CD151-ARSA組(0.1153±0.0076)細胞增殖能力最弱，比較有顯著性差異(P<0.05)(圖7)。說明CD151在HUVECs的增殖中具有重要的作用，能夠促進內(nèi)皮細胞的增值，而CD151-ARSA則減弱內(nèi)皮細胞的增值。同樣，CD151促進內(nèi)皮細胞的遷移。CD1

7、51組(25.78±3.19)與Control組(15.26±2.13)和GFP組(13.93±2.51)比較細胞遷移能力明顯增強，有顯著性差異(*P<0.05)；在4組細胞中，CD151-ARSA組(9.81±2.75)的細胞遷移能力最弱，與其他三組比較有顯著性差異(*P<0.05及[＃]P<0.05)(圖8)。說明CD151能夠促進細胞的遷移，CD151-ARSA突變體使細胞遷移能力減弱。轉(zhuǎn)染病毒后HUVECs細胞中整合素a3b1/

8、a6b1表達水平發(fā)生明顯變化，CD151組較其他三組有明顯增加(P<0.05)，CD151-ARSA組較CD151組明顯減少([＃]P<0.05)；而且在整合素內(nèi)化試驗中，CD151組內(nèi)化的整合素b1較其他三組有明顯增加(P<0.05)，而CD151-ARSA組比Control組及GFP組明顯減少(*P<0.05)。
　　 結論：1. 成功構建CD151-ARSA突變體并包裝成重組腺相關病毒，為進一步研究CD151的功能和作用機

9、制奠定了基礎；
　　 2. CD151可以促進HUVECs細胞的增殖與遷移，而CD151-ARSA突變體則減弱內(nèi)皮細胞的增殖及遷移能力；
　　 3. CD151能夠促進整合素a3b1/a6b1在HUVECs細胞中的表達，而且能夠促進整合素b1的內(nèi)化；而CD151-ARSA突變體不增加整合素a3b1/a6b1的表達，卻減少整合素b1的內(nèi)化；
　　 4.CD151可能是通過C末端囊泡運輸基序YRSL245-248影響