重組人Galectin-1蛋白的表達、純化及生物活性檢測.pdf

1、Galectin-1為半乳糖凝集素(galectin)家族的重要成員之一，由135個氨基酸組成，與β-半乳糖苷具有特殊親和力，常以單體和同源二聚體形式存在，表達于多種類型的細胞，在胸腺、平滑肌、腎臟、心肌、骨骼肌中含量豐富，具有重要的生物學功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Galectin-1參與系統(tǒng)發(fā)育并調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的增殖。在免疫系統(tǒng)中，Galectin-1誘導胸腺細胞和活化的T細胞的凋亡從而對T細胞進行調(diào)節(jié)，并抑制炎性因子的分泌。在某些腫瘤組織中

2、發(fā)現(xiàn)Galectin-1高表達，普遍參與腫瘤的發(fā)生、遷移、黏附，腫瘤血管的生成。
　　目前大量研究表明Galectin-1可以預防和治療多種自身免疫性疾病，具有廣闊的臨床應用前景。然而，相關的動物模型實驗必須給予相對高濃度的Galectin-1才能得到理想的結果。若應用于人體，則每天的劑量相當于4mg/kg，這樣大的劑量無疑給Galectin-1應用于臨床帶來了困難。因此，如何提高Galectin-1的活性已成為其應用于臨床急需解

3、決的問題。
　　文獻報道在體內(nèi)，二聚體Galectin-1在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過程中較單體Galectin-1具有更高的活性。而且，PatrickBttig等將兩個Galectin-1基因串聯(lián)在一起，表達的二串體重組蛋白在誘導鼠類胸腺細胞和成熟T細胞凋亡試驗中比天然的單體Galectin-1表現(xiàn)出更強的誘導凋亡活性。因此，本課題擬采用類似設計方案，表達單體和二串體Galectin-1，篩選高活性蛋白。
　　為了實現(xiàn)上述目的，首

4、先本課題以含有Galectin-1基因的質(zhì)粒pACT-Gal-1為模板，利用PCR技術獲得單體Galectin-1基因及二串體Galectin-1基因，并選擇帶有his標簽的質(zhì)粒pQE-30和本教研室改構的不含his標簽的表達質(zhì)粒pET-22b(+)為表達載體，通過雙酶切后，將基因與表達載體相連接，構建含有Galectin-1基因的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15和BL21(DE3)感受態(tài)細胞，構建工程菌。然后，經(jīng)IPTG誘導表達，SD

5、S-PAGE分析目的蛋白表達情況，再經(jīng)Ni柱親和層析及陰陽離子交換等不同層析方法純化目的蛋白。最后，通過紅細胞凝集試驗和Jurkat細胞增殖抑制試驗檢測純化所得目的蛋白的生物活性。
　　本課題通過對以上三方面的研究，共獲得如下結果：
　　1)成功構建了M15/pQE-30-Gal-1、BL21/pET-22b(+)-Gal-1、BL21/pET-22b(+)-Gal-1②工程菌，雙酶切鑒定和基因測序結果均正確。
　　2

6、)通過Ni柱親和層析得到純度大于95％的His-Gal-1蛋白；通過Q陰離子交換層析和SP陽離子交換層析純化得到純度約為90％的Gal-1蛋白和二串體Gal-1②蛋白，Westernblot結果顯示均為預期目的蛋白。
　　3)三種重組蛋白均有紅細胞凝集活性和抑制Jurkat細胞增殖活性，且二串體Gal-1②蛋白較His-Gal-1和Gal-1蛋白表現(xiàn)出了更強的生物活性。
　　綜上所述，我們得到了高活性的Gal-1②重組蛋白，