OCTN1、OCTN2及TNFα基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關性的研究.pdf

1、背景和目的： 炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）。近年來IBD的發(fā)病率尤其是CD的發(fā)病率呈上升趨勢，隨著雙氣囊小腸鏡的應用，CD的檢出率逐年上升。以往一直認為IBD是一種自身免疫性疾病，而近年來諸多研究證明IBD特別是CD具有明顯的遺傳易感性。目前較為一致的觀點認為，炎癥性腸病是

2、攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素作用下，自身免疫功能紊亂導致的一種非特異性炎癥性疾病。因此遺傳因素在炎癥性腸病的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。隨著人類基因組計劃的完成，對基因研究的重點已由全基因組序列測定轉移到了對基因組中個體基因多態(tài)性和功能的研究。個體基因多態(tài)性的主要形式是單鏈核苷酸多態(tài)性（Singl enucleotide polymorphism，SNP），SNP被公認為繼“限制性片段長度多態(tài)性”和“微衛(wèi)星多態(tài)性”這兩種遺傳標記之

3、后出現的“第三代DNA遺傳標記”，是目前全世界基因研究領域的熱點之一。 2001年歐洲Hugot研究小組及美國Ogura研究小組幾乎同時發(fā)現了人類第一個CD易感基因NOD2基因，后改名為CARD15，并證實該基因的3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點Arg702Trp、Gly908Arg和Leu1007fsinsC是白種人CD的易感基因，但后續(xù)的研究證明此三個SNP位點與日本人及我國香港人、浙江人CD患者無關。我們課題組對廣東地區(qū)C

4、D患者NOD2基因的上述三個SNP位點進行研究發(fā)現其與CD無顯著相關，但通過基因測序的方法發(fā)現了可能與中國人CD密切相關的P268S位點，并已成功構建了該位點的突變型真核表達載體。此后，西方多個研究小組通過全基因掃描的方法分別對歐洲高加索人、猶太人、英國、法國、巴爾干、德國、加拿大（魁北克）等地區(qū)的IBD患者進行研究，發(fā)現了一些與IBD，特別是CD患者密切相關的SNP位點，主要位于OCTN1、OCTN2、TNFα、IL23R、 ATG1

5、6L1、PTPN2、10q21、NKX2、IRGM、MST1、DLG5、5p31等基因中。其中位于OCTN1基因中的rs1050152位點、OCTN2基因中的rs2631367位點和位于TNFα基因中的G-308A位點具有顯著的統(tǒng)計學意義。rs1050152位于OCTN1基因第9外顯子中，正常為C，突變?yōu)門，導致第503位的氨基酸由亮氨酸（Leu）變成苯丙氨酸（Phe），而影響對肉毒堿的轉運，使細胞內肉毒堿含量下降，導致脂肪酸氧化受抑，

6、能量產生不足，最終出現細胞代謝紊亂；rs2631367位于OCTN2基因啟動子區(qū)，正常為G，突變?yōu)镃，其發(fā)病機制可能是該突變破壞了OCTN2基因的熱休克元件（heart shock element），從而影響肉毒堿的轉運，Peltekova等首次報道了以上兩個SNP位點與歐洲CD患者明顯相關，存在其中一個突變可使CD的患病風險提高2．5倍，同時具有兩個變異發(fā)病風險提高4倍；G-308A位于TNFα基因啟動子區(qū)，Wilson等首先報道了T

7、NFα基因啟動子區(qū)域內-308位點的雙等位基因多態(tài)性，各項研究表明TNFα在IBD的發(fā)病中起重要作用，G-308A位點多態(tài)性可影響TNFα的生物學作用從而可能參與IBD的發(fā)病。 本研究目的是通過基因測序和限制性片段長度多態(tài)性的方法初步探索與西方人CD患者相關的上述三個多態(tài)性位點與中國部分漢族人IBD患者的相關性，進一步為IBD的發(fā)病機制提供理論依據，并有可能為臨床治療IBD提供一種新的基因治療靶點。 材料和方法：

8、 1.收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化科及普外科確診、臨床資料完整、彼此無血緣關系的廣東及外省籍（湖南、湖北、江西、福建、廣西等）CD和UC患者（診斷標準采用2007年制定的IBD診斷標準，所有患者均除外合并其他自身免疫性疾病）各45例。UC患者中病變位于直腸6例，左半結腸12例，右半結腸6例，全結腸21例，其中男26例、女19例，平均年齡（35．58±15．81）歲；CD患者中病變部位位于小腸19例，結腸14例，小腸合并結腸9例，直腸3例

9、，其中男28例、女17例，平均年齡（32，91±10．54）歲。對照組取門診健康體檢者50例，其中男32例、女18例，平均年齡（37．62±12．62）歲。所有研究對象均抽取外周血5ml。 2.CD、UC及健康對照組均于清晨空腹抽取外周靜脈血5ml置于加入枸櫞酸鈉的抗凝管中，-20℃保存。按TIANGEN公司提供的試劑盒說明書操作，應用特異性結合DNA的硅基質材料離心吸附柱法提取血液白細胞基因組DNA，提取成功后置-70℃保存。

10、 3.針對上述三個SNP位點用Primer5．0軟件設計PCR引物，PCR方法擴增分別包含這三個SNP位點在內的DNA片段，擴增產物以1．5%瓊脂糖凝膠電泳觀察以確保目的片段擴增成功，然后采用切膠純化試劑盒（TIANGEN公司提供）將目的片段純化回收，并用分光光度計檢測純化產物濃度。 4.將純化產物分別采用DNA直接測序法和聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length p

11、olymorphism polymerase chain reaction products，PCR-RFLP）進行研究；測序結果用chromas2判讀SNP位點的基因型。酶切產物以2．0%瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果判讀SNP位點的基因型。采用基因計數法計算三個SNP位點基因型頻率和等位基因頻率，最后進行統(tǒng)計學分析。 結果： 1.OCTN1基因多態(tài)性位點rs1050152與中國部分漢族炎癥性腸病的相關性： 通過

12、DNA測序發(fā)現，OCTN1基因第9外顯子上的rs1050152位點只有少數發(fā)生雜合突變（CT），所有三組研究對象均未發(fā)現純合突變（TT），其中CD組有3例，UC組有4例，健康對照組有6例發(fā)生雜合突變，以上發(fā)生突變的樣本均通過反向測序驗證。CD患者該位點基因型頻率為6．7%，等位基因頻率為3．3%，UC患者該位點基因型頻率為8．9%，等位基因頻率為4．4%。CD組、UC組與對照組該位點基因型頻率和等位基因頻率（12．0%和6．0%）比較三

13、組間差異均無統(tǒng)計學意義（x2值分別=0．812和0．770；P值分別=0．715和0．727）。提示rs1050152位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群IBD無明顯相關性。 2.OCTN2基因多態(tài)性位點rs2631367與中國部分漢族炎癥性腸病的相關性： DNA測序發(fā)現CD患者、UC患者及健康對照者該位點基因型均全部為野生型純合子GG，即未發(fā)現G-207C突變型基因型。提示rs2631367位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群I

14、BD無明顯相關性。 3.TNFα基因多態(tài)性位點G-308A與中國部分漢族炎癥性腸病的相關性： 通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），CD患者、UC患者及健康對照者該位點基因型均全部為野生型純合子GG，即未發(fā)現G-308A突變型基因型。提示G-308A位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群IBD無明顯相關性。 結論： 1.國外報道的與西方人CD易感性相關的OCTN1基因多態(tài)性位點rs105