銅綠假單胞菌內(nèi)在耐藥性相關(guān)基因的篩選及研究.pdf

1、二十世紀五十年代后,由于持續(xù)不合理的使用抗生素,臨床細菌的耐藥性現(xiàn)在已經(jīng)成為全球感染領(lǐng)域引人矚目的問題之一。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性條件致病菌,主要在臨床中引起一定程度的感染。由于銅綠假單胞菌自身的特點:如細胞本身對抗生素的通透性低,形成生物被膜等,賦予了銅綠假單胞菌特有的內(nèi)在抗藥性。正是由于銅綠假單胞菌抗藥性的出現(xiàn),使得對于銅綠假單胞菌感染的治療變得非常的棘手。因此,對于銅綠假單胞菌

2、內(nèi)在抗藥性的研究就變得至關(guān)重要。
　　 為了尋找銅綠假單胞菌中與抗生素抗性相關(guān)的基因,我們構(gòu)建了含有17000多個克隆的隨機轉(zhuǎn)座突變體庫,并用不同類型的七種抗生素對轉(zhuǎn)座突變體庫進行了篩選。首先,在含有最小抑制濃度(Minimal Inhibitors Concentration,MIC)的固體平板上生長的轉(zhuǎn)座突變體,被認為是抗性轉(zhuǎn)座突變體。在1/2最小抑制濃度(MIC)的固體平板上不能生長的轉(zhuǎn)座突變體被認為是敏感轉(zhuǎn)座突變體。然后

3、對固體平板篩選出來的轉(zhuǎn)座突變體在液體培養(yǎng)基中重新進行一次篩選,并且確定每個轉(zhuǎn)座突變體各自的最小抑制濃度(MIC)。最終通過隨機PCR、測序和比對,確定了轉(zhuǎn)座突變體庫中的43個轉(zhuǎn)座突變體的突變位點(即43個基因)。這些轉(zhuǎn)座突變體與野生型的銅綠假單胞菌相比較至少對一種抗生素的敏感程度發(fā)生了3倍或者3倍以上的變化。還有一些轉(zhuǎn)座突變體對三種抗生素都有3倍以上的變化,比如:PA4024、PA4342和PA4456的轉(zhuǎn)座突變體。有兩個轉(zhuǎn)座突變體對羧

4、芐青霉素的抗性提高了128倍。在這43個基因當中,現(xiàn)已經(jīng)報道的與抗生素有關(guān)的基因有三個,他們是PA0424(編碼多重耐藥操縱子的抑制蛋白MexR)、PA0426(編碼與抗生素抗性相關(guān)的RND外排泵的蛋白MexB；Resistance-Nodulation-CellDivision)和PA4207(編碼與抗生素抗性相關(guān)的RND外排泵的蛋白).而其它基因并未見其與抗生素抗性有關(guān)的報道。
　　 銅綠假單胞菌中被預(yù)測為ABC轉(zhuǎn)運器的蛋白

5、很多?，F(xiàn)在已經(jīng)清楚的知道ATP依賴的ABC轉(zhuǎn)運器在生物體中具有非常重要的作用。在我們篩選得到的結(jié)果中,PA4456被預(yù)測可能是ATP依賴的ABC轉(zhuǎn)運器的組成部分,為了進一步確定其基因的功能,我們對其進行了深入的研究,如抗生素敏感性的測定,熒光分光光度法測定了細胞內(nèi)四環(huán)素的積累等。結(jié)果表明:(1)PA4456基因在細胞對四環(huán)索和有機溶劑的轉(zhuǎn)運過程具有重要的功能；(2)PA4456突變體對氯霉素(Chloramphenicol)、氨甲氧嘧啶

6、(Trimethoprim)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、二甲苯(Xylene)、二甲基甲酰胺(Dimethy-formamide)和甲苯(Toluene)的敏感性增加。
　　 為了了解其基因功能的調(diào)控機理,我們通過隨機轉(zhuǎn)座突變的方法從整個基因組水平篩選對PA44.56具有調(diào)節(jié)作用的基因,最終我們發(fā)現(xiàn)PA1180(phoQ)對PA4456具有潛在的抑制調(diào)節(jié)作用,在phoQ突變體中,PA4456的表達增加了8倍之多。<