含hTK1和hTIMP1雙基因共表達重組腺病毒載體的構(gòu)建及對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、目的:本課題前期研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導的組織激肽釋放酶1(hTK1)基因過表達具有部分抑制血管平滑肌細胞增殖和改善血管再狹窄的作用,但聯(lián)合基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)對血管平滑肌細胞增殖是否具有協(xié)同效應,目前尚不明了。本課題首先構(gòu)建含hTK1和hTIMP1雙基因共表達的重組腺病毒載體和含基因hTIMP1的重組腺病毒載體,并檢測病毒滴度。隨后觀察比較雙基因共表達載體與單基因表達載體,轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞(VSMCs)后,測定其感

2、染率以及對血小板源性生長因子(PDGF-BB)誘導VSMCs增殖的影響。
　　方法:
　　第一部分:
　　1、由Invitrogen公司購買含hTIMP1基因的原始質(zhì)粒,經(jīng)鑒定后,選擇相對應內(nèi)切酶,酶切hTIMP1基因片段和含強綠色熒光蛋白基因(EGFP)穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP,經(jīng)連接熱激、轉(zhuǎn)化及構(gòu)建含hTIMP1和EGFP基因的重組穿梭質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切和測序分析進行鑒定。
　　2、對含hTIMP1重

3、組穿梭質(zhì)粒應用限制性內(nèi)切酶BgⅢ/SaⅡ,進行酶切并擴增、回收含啟動子cmv的片段cmv-hTIMP1片斷,選擇對應酶切位點同時酶切質(zhì)粒pDC316-hTK1載體(本研究室保存)并回收,并將上述產(chǎn)物進行連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ后挑取正確克隆,構(gòu)建含雙啟動子和雙基因的重組穿梭質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切分析和測序分析進行鑒定該質(zhì)粒。
　　3、將上述兩個重組穿梭質(zhì)粒線性化,并同腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre轉(zhuǎn)染2

4、93A細胞,在293A細胞包裝含hTIMP1基因和hTK1和hTIMP1雙基因的重組腺病毒載體,并經(jīng)PCR鑒定毒種中的目的基因;以經(jīng)典TICD50法測定病毒滴度。
　　第二部分:
　　1、組織塊貼壁法體外培養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動脈VSMCs,觀察細胞生長狀態(tài)并用Alpha Smooth Muscle Actin單克隆抗體經(jīng)細胞免疫組化法鑒定正確性。
　　2、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測重組腺病毒

5、感染率。
　　3、細胞計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法分別檢測細胞增殖改變。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、經(jīng)PCR法、雙酶切法和測序三種方法檢測證實,含hTIMP1和EGFP的重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP,和含hTK1和hTIMP1基因的pDC316-cmv-hTK1-cmv-hTIMP1構(gòu)建正確。
　　2、上述兩個重組穿梭質(zhì)粒分別與骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre在2

6、93A細胞中成功包裝了含hTIMP1的Ad5-hTIMP1-EGFP重組腺病毒載體,和含hTK1和hTIMP1基因的Ad5-hTK1-hTIMP1重組腺病毒載體,并經(jīng)毒種PCR證實了目的基因正確性。
　　3、經(jīng)TICD50法測定兩種重組腺病毒滴度:Ad5-hTIMP1-EGFP為7.0×1011vp/ml,Ad5-hTK1-hTIMP1為8.5×1011vp/ml。
　　第二部分:
　　1、成功原代培養(yǎng)了大鼠VSMCs

7、,細胞呈梭形、紡錘形,7-10天,細胞彼此融合,呈束狀排列,部分出現(xiàn)旋窩“峰和谷”樣的生長模式:經(jīng)細胞免疫組化鑒定胞漿內(nèi)a-SM免疫熒光陽性表達,呈紅色絲狀條紋,說明培養(yǎng)的細胞是血管平滑肌細胞,純度達95％以上,VSMCs純度高。
　　2、Ad5-hTK1-EGFP轉(zhuǎn)染細胞后,感染率呈濃度(20-100MOI)和時間(1-4d)依賴性增加,在100MOI和第4天時最高感染率為99.57%;Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率同樣

8、呈濃度(20-150MOI)和時間(1-5d)依賴性增加,在150MOI和第5天時,最高感染率為98.14%。
　　3、細胞計數(shù)法和MTT法結(jié)果顯示:與control組相比,PDGF-BB可明顯促進細胞增殖生長(P<0.01);對照病毒組與單純PDGF-BB誘導組的細胞增殖無明顯差異;三種重組腺病毒Ad5-hTK1-EGFP、Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1呈時間(2-5d)依賴性和感染復數(shù)(20-1

9、50MOI)依賴性抑制PDGF-BB誘導VSMCs增殖;含雙基因腺病毒載體的抑制效應明顯強于單基因腺病毒(Ad5-hTK1-EGFP和Ad5-hTIMP1-EGFP)(p<0.01),在第5天150MOI時的抑制率達50.97%。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過雙啟動子策略,首次成功構(gòu)建和包裝含hTK1和hTIMP1雙基因的共表達重組腺病毒載體Ad5-hTK1-hTIMP1,同時成功構(gòu)建含hTIMP1的重組腺病毒載體Ad5-