心肌梗死后轉染VEGF-,165-基因的自體骨胳肌成肌細胞移植治療的實驗研究.pdf

1、目的：成肌細胞移植在動物實驗和Ⅰ期臨床試驗中已證實可改善梗死后的心室功能，其具體機制尚未闡明，但普遍認為植入細胞的存活數(shù)量與心功能改善程度密切相關。我們設想聯(lián)合應用細胞移植治療和基因血管治療：以脂質體介導VEGF165基因轉染入兔自體骨胳肌成肌細胞后移植于兔心肌梗死區(qū)，使經脂質體介導的VEGF165基因促毛細血管生成作用能適度的，適時的表達。以期證明轉基因后的成肌細胞移植能更好的改善心梗區(qū)的血供，提高移植細胞的存活率，從而較單純的細胞移

2、植治療能更好的改善心功能。 方法：第一部分：體外分離、純化、培養(yǎng)及鑒定新西蘭兔成肌細胞，并利用pcDNA3.1-EGFP真核表達載體優(yōu)化出脂質體LipofectamineTM2000體外轉染新西蘭兔成肌細胞的最佳條件，以用于目的基因VEGF165的轉染。 第二部分：將pcDNA3.1-VEGF165質粒用脂質體導入新西蘭兔自體成肌細胞中，通過RT-PCR、Westen-blot和ELISA在轉錄水平和蛋白質水平上檢測VE

3、GF165在成肌細胞中的體外強度和時限。 第三部分：在新西蘭兔心肌梗死后2周，分別將轉染VEGF165的成肌細胞，成肌細胞和細胞培養(yǎng)液注入各組的心肌梗死區(qū)，4周后觀察心功能改善情況，心梗邊緣區(qū)毛細血管密度及植入細胞的鑒定。 結果：第一部分：體外培養(yǎng)可獲得純度為85.4±6.7％Desmin陽性的成肌細胞，優(yōu)化條件后脂質體介導的轉染可獲得31.7±3.4％的轉染率。 第二部分：轉基因成肌細胞經RT-PCR擴增出一條

4、大小約600bp的特異性泳帶，測序結果與VEGF165mRNA一致。Westernblot檢測到大小為23KD的特異性蛋白質條帶。ELISA顯示體外培養(yǎng)的VEGF165轉染的成肌細胞可持續(xù)1周左右強度為103.72±8.10ng/ml的蛋白分泌量。 第三部分：轉染VEGF165的成肌細胞移植組，成肌細胞移植組和對照組超聲心功能指標比較(LVESV1.02±0.17ml，1.30±0.18mlVs1.50±0.19ml，P＜0.0

5、5；LVEDV4.44±0.47ml，5.01±0.53mlVs5.55±0.51ml，P＜0.05；EF68.41±7.77％，57.76±7.15％Vs42.55±5.78％，P＜0.05)顯示轉染VEGF165的成肌細胞移植組心功能顯著改善。以上三組心梗邊緣區(qū)毛細血管密度的比較(31.53±7.88個/200倍視野，12.17±2.66個/200倍視野Vs3.02±0.68個/200倍視野，P＜0.05)顯示轉染VEGF165的成

6、肌細胞移植組的心梗邊緣區(qū)毛細血管密度最大。免疫組化證實植入的成肌細胞為肌源性，但與心肌細胞間未觀察到任何形式的連接。 結論：1.采用反復差速貼壁法培養(yǎng)可在體外獲得大量高純度的骨骼肌成肌細胞。 2.陽離子脂質體法能介導pcDNA3.1-VEGF165質粒在體外培養(yǎng)的兔成肌細胞中可持續(xù)1周較高強度的VEGF165蛋白分泌。 3.植入的肌源性成肌細胞與心肌細胞無直接聯(lián)系。 4.轉染VEGF165的成肌細胞移植組