肝癌靶向多肽的篩選及X1-MePEG-PLA-CS納米粒的靶向性研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率居惡性腫瘤的第2位。HCC的治療方法主要包括肝切除術(shù)、原位肝移植、肝動(dòng)脈栓塞化療、經(jīng)皮無(wú)水酒精注射、射頻消融、微波消融、冷凍術(shù)、放療、抗激素療法、生物治療及中藥治療等。目前,手術(shù)切除仍是治療原發(fā)性肝癌的首選方法,然而肝癌患者實(shí)施根治性切除后,5年復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高,仍是肝癌臨床治療的難題。
　　 近年來(lái),隨著基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的日趨

2、成熟,基因治療已經(jīng)成為生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。納米?；蜣D(zhuǎn)運(yùn)體是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型的非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。它是將DNA、RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,同時(shí)也在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子,通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合,在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入胞內(nèi),實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。篩選肝癌細(xì)胞特異性靶向分子,并將其與納米基因載體結(jié)合,已成為提高納米基因載體肝癌治療效果的關(guān)鍵問(wèn)題之一。
　　 為

3、此,本文通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù),篩選獲得了一批能夠與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽,對(duì)其與肝癌細(xì)胞的結(jié)合特異性進(jìn)行鑒定。本研究為制備納米基因載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),使其能有效的保護(hù)轉(zhuǎn)運(yùn)基因不被核酶降解,并具備較高的基因轉(zhuǎn)染效率、有效的輸送基因至靶位點(diǎn)以及良好的生物相容性奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分噬菌體肽庫(kù)技術(shù)篩選人肝癌細(xì)胞HepG2特異性粘附肽
　　 目的：
　　 通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù),使用體外細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi),篩選出能夠

4、和人肝癌細(xì)胞HepG2結(jié)合緊密的短肽。
　　 方法：
　　 (1)以人肝癌細(xì)胞(HepG2)為篩選靶細(xì)胞,對(duì)噬菌體隨機(jī)十二庫(kù)(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)進(jìn)行三輪體外細(xì)胞篩選。建立HepG2荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,進(jìn)行一輪動(dòng)物體內(nèi)篩選。
　　 (2)通過(guò)體外、體內(nèi)共四輪篩選后,隨機(jī)挑取30個(gè)噬菌體克隆,取DNA序列測(cè)定,并進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析。

5、r>　　 結(jié)果：
　　 (1)經(jīng)過(guò)篩選使噬菌體在HepG2細(xì)胞上出現(xiàn)了顯著富集,回收噬菌體的滴度由第一輪的7.2×103pfu增加到第三輪篩選后的2.5×106pfu,增加了300余倍,回收率也顯著提高,由第一輪的4.8×10-6增至第三輪篩選后的1.67×10-3。
　　 (2)挑取的30個(gè)樣本中有27個(gè)噬菌體克隆測(cè)序結(jié)果有效,這些噬菌體克隆的序列中有部分重復(fù),其中序列X1重復(fù)19次,序列X2重復(fù)3次,序列X3重復(fù)4

6、次,序列X4重復(fù)1次。重復(fù)最多的序列為X1(QSFASLTDPRVL)。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn),在已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)與此短肽序列完全一致或具有較好同源性的蛋白質(zhì)分子。
　　 結(jié)論：
　　 成功地從噬菌體隨機(jī)12肽文庫(kù)中篩選到了在體內(nèi)、體外均具有特異性靶向肝癌細(xì)胞和肝癌組織能力的噬菌體克隆。
　　 第二部分肝癌特異性粘附肽的特異性鑒定
　　 目的：
　　 分析鑒定X1噬菌體克隆及人工合成短肽SA

7、1與肝癌細(xì)胞HepG2及肝癌組織結(jié)合的特異性。
　　 方法：
　　 (1)ELISA法鑒定所選噬菌體單克隆與HepG2細(xì)胞的結(jié)合特異性。
　　 (2)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色,鑒定X1噬菌體克隆與肝癌細(xì)胞結(jié)合的特異性：通過(guò)免疫組織化學(xué)染色,鑒定X1噬菌體克隆與人肝癌組織結(jié)合的特異性。
　　 (3)利用免疫熒光技術(shù)觀察人工合成肽SA1與肝癌細(xì)胞HepG2的結(jié)合特異性。
　　 (4)體內(nèi)回輸、免疫組織化學(xué)

8、方法鑒定噬菌體克隆在體內(nèi)的特異性靶向效果。
　　 結(jié)果：
　　 (1)所篩選出來(lái)的噬菌體都具有較好的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合能力,其中陽(yáng)性最高的克隆也正是在隨機(jī)測(cè)序中重復(fù)頻率最高的序列為X1的噬菌體克隆。
　　 (2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色均顯示,X1噬菌體克隆對(duì)肝癌細(xì)胞的結(jié)合靶向性明顯高于對(duì)照細(xì)胞,并能與肝癌組織特異性結(jié)合。
　　 (3)免疫熒光顯色證實(shí),FITC-SA1肽能特異性地結(jié)合于肝癌細(xì)胞

9、的胞膜及核周胞漿。
　　 (4)噬菌體肽X1在腫瘤組織中比其他正常組織中有更高的富集效果,說(shuō)明通過(guò)血液循環(huán),此噬菌體肽能與腫瘤組織能特異性結(jié)合。結(jié)論：
　　 X1肽(QSFASLTDPRVL)是所有篩選得到的克隆中具有最強(qiáng)的特異性結(jié)合能力的,可以特異性地結(jié)合肝癌細(xì)胞和肝癌組織,而與正常肝細(xì)胞和肝組織沒(méi)有明顯的結(jié)合。同時(shí)X1肽具有很好的體內(nèi)靶向活性,可以通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)迅速、特異地富集到腫瘤組織中。
　　 第三部分

10、 X1/MePEG-PLA-CS納米粒的制備及其靶向性研究
　　 目的：
　　 構(gòu)建納米基因載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),使其能有效的保護(hù)轉(zhuǎn)運(yùn)基因不被核酶降解,并具備較高的基因轉(zhuǎn)染效率、有效的輸送基因至靶位點(diǎn)以及良好的生物相容性。
　　 方法：
　　 (1)制備甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-殼聚糖(MePEG-PLA-CS)納米粒,檢測(cè)其粒徑、DNA結(jié)合效率及細(xì)胞毒性。
　　 (2)將噬菌體X1肽與MePEG-PLA-

11、CS納米顆粒偶聯(lián),觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　 結(jié)果：
　　 (1)制備的MePEG-PLA-CS納米粒粒徑為103.2±9.6 nm,表面帶正電荷,DNA結(jié)合效率為93.2±2.9％,可保護(hù)所攜帶DNA免受核酸酶的降解；對(duì)正常的肝細(xì)胞(L-02)在一定的劑量范圍內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性,只在高濃度下才會(huì)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性作用。
　　 (2)與脂質(zhì)體、MePEG-PLA-CS納米粒比較,偶聯(lián)了噬菌體X1肽的MeP