蘄艾提取液對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)及肝星狀細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景：肝纖維化(HF)是慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，其實(shí)質(zhì)在于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活增殖是引起肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，阻抑激活的HSC活化、增殖及促進(jìn)HSC凋亡是治療肝纖維化的重要途徑。TGFβ1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)湖北省的道地藥材-蘄艾有明顯的抗肝纖維化的作用，為進(jìn)一步研究該藥的抗肝纖維化作用機(jī)制，本研究擬對(duì)蘄艾提取液對(duì)

2、肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)及肝星狀細(xì)胞的影響進(jìn)行探討。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)以異種血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠模型為研究對(duì)象，觀察道地中藥材制劑蘄艾提取液對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的影響；通過研究蘄艾提取液藥物血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖、凋亡及對(duì)TGFβ1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，從分子生物學(xué)水平闡明蘄艾提取液抗纖維化作用的機(jī)制。
　　 方法：
　　 (一)蘄艾提取液對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的影響：Wi

3、star大鼠60只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和高、中、小劑量蘄艾提取液治療組，采用異種血清腹腔內(nèi)注射構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，HE染色后，光鏡下觀察大鼠肝組織纖維化程度；SABC型免疫組化染色法觀察肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)含量變化，并對(duì)免疫組化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行圖像分析。
　　 (二)蘄艾提取液對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的影響：
　　 1.蘄艾提取液藥物血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制：傳代培養(yǎng)的大

4、鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6與蘄艾提取液藥物血清(5％、10％、20％)共同培養(yǎng)24小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及Western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)Cyclin D1蛋白及其mRNA的表達(dá)。
　　 2.蘄艾提取液藥物血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制：采用Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6凋亡及Western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)抗凋亡基因B

5、cl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 3.蘄艾提取液藥物血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞TGFβ1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響：Elisa檢測(cè)TGFβ1蛋白表達(dá)、Wes tern-blot及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白及其mRNA表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.在細(xì)胞外基質(zhì)方面：蘄艾提取液各治療組與同期模型組相比，肝纖維化程度明顯減輕。肝纖維化模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP

6、-1含量比正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，蘄艾口服液各治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1含量比模型組明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 2.在細(xì)胞增殖方面：不同濃度蘄艾提取液藥物血清(5％、10％、20％)與空白對(duì)照組及生理鹽水血清各組比較，均能顯著抑制HSC-T6增殖(P＜0.01)，其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。流式細(xì)胞儀分析顯示，蘄艾提取液藥物血清組G0/G1期細(xì)胞顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，而S期細(xì)

7、胞顯著下降(P＜0，05，P＜0.01)，但對(duì)于G2期無影響。細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。同時(shí)蘄艾提取液藥物血清可明顯抑制cyclin D1 mRNA及其蛋白表達(dá)(P＜0.01)，而且隨血清濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 3.在細(xì)胞凋亡方面：蘄艾提取液藥物血清組HSC-T6早期細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組及生理鹽水血清組(P＜0.01)，并且隨著血清濃度的增加，HSC-T6早期細(xì)胞凋亡率

8、逐漸增高，呈劑量依賴關(guān)系。同時(shí)蘄艾提取液藥物血清組可下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，而且隨血清濃度的增加，Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 4.在細(xì)胞TGFβ1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面：與空白對(duì)照組及生理鹽水血清組相比，蘄艾提取液藥物血清可顯著抑制HSC TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，上調(diào)Smad7

9、蛋白及其mRNA表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，而且隨藥物血清濃度的增高對(duì)HSC-T6 TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表達(dá)的抑制程度逐漸增強(qiáng)，而Smad7蛋白及其mRNA表達(dá)逐漸升高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.蘄艾提取液能夠下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1mRNA表達(dá)，減少肝內(nèi)膠原物質(zhì)的過度沉積。
　　 2.蘄艾提取液藥物血清能夠抑制HSC增殖，促進(jìn)HSC的凋亡。