腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及目的:隨著人口老齡化，惡性腫瘤的發(fā)病率隨之升高。乳腺癌曾經(jīng)是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活方式的西化，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這在沿海發(fā)達(dá)城市表現(xiàn)尤為明顯。乳腺癌患者的總體預(yù)后相對(duì)其他惡性腫瘤較好，然而，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率明顯降低。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是由單核細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下分化形成的，通常具有M2型巨噬細(xì)胞表型。研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在乳腺癌組織中較為常見，并且其豐度分布與預(yù)后不良相關(guān)，

2、具體機(jī)制不詳。本研究旨在探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在乳腺癌干細(xì)胞維系及其與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究乳腺癌細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞定向分化的調(diào)節(jié)及其干預(yù)措施。
　　方法:首先，通過分層隨機(jī)化收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年1月至2010年5月乳腺癌組織標(biāo)本120例，采用免疫組化技術(shù)分析M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD163在乳腺癌中的表達(dá)分布。通過向培養(yǎng)基中加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)人為誘導(dǎo)單核細(xì)胞株U937分化為M2

3、型巨噬細(xì)胞，采用鏡下觀察形態(tài)、RT-PCR及定量RT-PCR鑒定其表型。分別用不同活細(xì)胞染料(CMTMR，CMFDA)標(biāo)記經(jīng)誘導(dǎo)分化的U937細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞，利用體外促融合技術(shù)(聚乙二醇，PEG1450)輔助他們?nèi)诤希ㄟ^流式細(xì)胞儀(FACS)分選融合形成的雜交細(xì)胞。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)比較融合細(xì)胞與其來源乳腺癌細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的差異。其次，通過乳腺癌細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)比較不同雌激素受體(ER)狀態(tài)乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化能力

4、的差異。為此，我們利用慢病毒載體系統(tǒng)藥物篩選了分別帶GFP-PURO和RFP-NEO標(biāo)記的U937細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，模擬單核細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)的體內(nèi)過程，研究不同乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化遷移及侵襲能力。采用Bio-Plex multiplex human cytokine試劑盒檢測(cè)了不同ER狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞株單核細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子(MCP-1，M-CSF, IL6，GM-CSF等)的分泌情況。最后，通過三氧化二砷處理乳腺癌

5、細(xì)胞探索其對(duì)上述相關(guān)細(xì)胞因子分泌及乳腺癌細(xì)胞成瘤特性的影響。
　　結(jié)果:CD163在不同類型乳腺癌組織中的表達(dá)存在差異，在ER-乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)較ER+高，而且CD163的表達(dá)高低是預(yù)后不良的獨(dú)立因素。經(jīng)過(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)及MCSF的誘導(dǎo)，單核細(xì)胞株U937分化成M2型巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)在形態(tài)及免疫表型上表達(dá)CD163、CD204。在PEG的輔助下分化的U937細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞株MCF7及MDA-MB

6、231存在一定的融合現(xiàn)象，經(jīng)FACS分選出來的雜交細(xì)胞在免疫表型及生物特性上同其來源細(xì)胞均有一定差異。表現(xiàn)在雜交細(xì)胞具有更高的CD44+CD24-乳腺癌干細(xì)胞表型，同時(shí)高表達(dá)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)相關(guān)基因。體外實(shí)驗(yàn)表明雜交細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移侵襲，而增殖能力較其來源細(xì)胞弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，雜交細(xì)胞成瘤能力及轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)。
　　在乳腺癌細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)后者定向分化的研究中發(fā)現(xiàn)MDA-MB231細(xì)胞能在較短時(shí)間（一周）內(nèi)將

7、U937細(xì)胞定向分化為具有M2表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，而MCF7細(xì)胞不具有短期誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化的能力。通過定量PCR及Bio-Plex multiplex human cytokine試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDA-MB231與MCF7在誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化的相關(guān)細(xì)胞因子（M-CSF, IL6等）的表達(dá)上存在明顯差異，這一結(jié)果與其在誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化的功能上完全吻合。
　　三氧化二砷(As2O3)是一種礦物類中藥，在抗腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)其具

8、有誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)分化的作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)亞致死劑量的As2O3能夠抑制MDA-MB231細(xì)胞分泌促單核細(xì)胞定向分化的細(xì)胞因子M-CSF及IL6。在MDA-MB231細(xì)胞形成的移植瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)As2O3能夠降低成瘤小鼠外周血中相關(guān)細(xì)胞因子水平，使瘤體壞死及癌細(xì)胞ER狀態(tài)轉(zhuǎn)換。
　　結(jié)論:M2巨噬細(xì)胞能夠通過與乳腺癌細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移;形成的雜交細(xì)胞具有部分乳腺癌干細(xì)胞的特性;不同ER狀態(tài)