成骨因子NELL1在大鼠股骨牽張成骨中促皮質骨生成的研究.pdf

1、目的：為了加速四肢長骨牽張成骨（DO）過程中新骨的形成、礦化及塑型改建，將具有特異性促進成骨分化及礦化功能的NELL1因子應用于大鼠股骨牽張成骨模型，通過創(chuàng)新性的外固定架設計及動態(tài)Micro-CT觀察，研究NELL1因子對股骨牽張成骨的影響，從而為臨床上治療四肢大段骨缺損尋找一種快速有效的治療方法。方法：構建同時攜有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因和NELL1基因的重組腺病毒載體Ad-GFP-NELL1，經擴增、純化后轉染大鼠骨髓基質細胞

2、（BMSCs）觀察其體外對BMSCs的影響。進一步應用自行研制的大鼠股骨DO外固定架系統(tǒng)將30只SD大鼠隨機分為3組，每組于術后14天分別于骨延長局部注射等量Ad-GFP-NELL1、Ad-GFP、生理鹽水，術后21、28、42、56天麻醉后行X線及活體Micro-CT檢查，并于術后28天，各組取1只采用小動物活體熒光成像系統(tǒng)檢測NELL1及GFP表達情況。其余動物于術后56天取材行行生物力學、組織學及免疫組化檢測。結果：①成功構建出A

3、d-GFP-NELL1重組腺病毒，純化后獲得滴度高達1×1011pfu/ml。②用構建好的病毒轉染鑒定過的大鼠BMSCs后，NELL1蛋白及GFP均陽性表達，轉染后對細胞的生長無明顯影響。③Micro-CT動態(tài)觀察大鼠股骨DO模型顯示：在靜息期及延長期，延長區(qū)無明顯新骨形成，延長區(qū)內主要為由纖維樣組織組成的假性生長板結構。在鞏固期前期（術后21～42天）主要為骨量的增加，表現為骨礦含量增加，骨小梁數量增多；鞏固后期（術后42～56天），

4、骨量仍持續(xù)增加，同時骨的質量也開始明顯提高，表現為骨小梁增厚，已礦化組織礦化度提高。在術后56天，延長區(qū)內仍處于成骨和骨結構的改建中，假性生長板基本消失，未骨化的軟骨組織依然存在。術后56天，DO側股骨的最大扭矩及失效能量均小于健側股骨。④Ad-GFP-NELL1局部應用于大鼠DO模型，注射后14天可見延長區(qū)NELL1蛋白表達。X線片顯示，術后56天，Ad-GFP-NELL1組9只延長區(qū)均達到骨性愈合，對照Ad-GFP、生理鹽水組分別為

5、4只、5只達到骨性愈合。生物力學測試Ad-GFP-NELL1組明顯優(yōu)于兩對照組，與正常股骨的抗扭強度相當。Micro-CT數據顯示：鞏固期前期3組數據無明顯差異；鞏固后期Ad-GFP-NELL1組骨痂增速減緩，骨體積分數（BVF）增速由前3周每周10％下降到6％。而兩對照組增加到13～14％。到術后56天，Ad-GFP-NELL1組骨體積分數（BVF）、礦化組織密度（BMD）均低于兩對照組。Micro-CT三維重建顯示：到鞏固期后期，A

6、d-GFP-NELL1組生成的骨痂以皮質骨為主，松質骨較少，骨髓腔貫通，形成了類似長骨管狀骨的結構，兩對照組形成了較多的骨痂，以松質骨為主，改建較差。組織學切片顯示：兩對照組延長區(qū)中央于術后56天仍有軟骨組織結構，而Ad-GFP-NELL1組未見明顯軟骨組織存留，均為骨痂結構。免疫組化結果顯示：3組RUNX2、BMP2、BMP7表達無明顯差異，Ad-GFP-NELL1組骨鈣素及骨橋蛋白表達高于兩對照組。結論：①構建并純化后的重組腺病毒載

7、體Ad-GFP-NELL1可高效轉染大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達NELL1和GFP兩種蛋白；②在大鼠股骨DO延長結束后應用可透X線的高分子材料固定牽引針可以獲得穩(wěn)定的固定并便于采用Micro-CT活體動態(tài)觀察及評價DO過程中新骨的形成；③長骨牽張成骨中骨量的增加自延長結束后開始，持續(xù)5周以上，骨質量的改建在延長結束后2～3周才開始，二者的發(fā)生具有時相性，提示相應的干預手段應在不同的時期進行；④NELL1具有促進股骨DO過程中皮質骨生成的作

8、用。在牽張成骨的環(huán)境下，NELL1與已應用于臨床的BMPs相比，并不是單純的促進局部新骨形成的量，而是促進缺損局部新骨的形成及骨痂的礦化、改建，形成較少但結構及生物力學強度更佳類似于長骨管狀骨結構的骨痂結構，從而加速牽張成骨的愈合。這一結果改變了過去認為NELL1只在顱骨、下頜骨等神經脊來源骨組織中具有促進成骨作用的結論。提示我們，NELL1因子應用于臨床可以縮短四肢牽張成骨術后患者攜帶外固定架的時間，有望使牽張成骨這種治療大段骨缺損的