抗-OX40-抗-AFP-納米微粒在CTL抗肝癌中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.利用生物相容性和生物可降解乳酸-羧基乙酸共聚物（PLGA）制備的納米微粒并與抗-OX40及抗-AFP抗體偶聯(lián)。2.觀察抗-OX40/抗-AFP納米微粒對(duì)CTL生物學(xué)效應(yīng)及抗肝癌作用的影響。
　　方法：1.根據(jù)沉淀法用PLGA、乙腈和F-127制備PLGA納米微粒，并用NHS和EDC活性偶聯(lián)劑在納米微粒表面偶聯(lián)上抗-OX40抗體和抗-AFP抗體。2.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用VarioMACS系統(tǒng)分選純化CD14+、CD8+

2、細(xì)胞，用“IL-4+GM-CSF”定向擴(kuò)增分化CD14+為DC細(xì)胞，用絲裂霉素滅活DC細(xì)胞,與CD8+細(xì)胞按照比例混合培養(yǎng)CTL細(xì)胞。3.用WST-1、ELISA方法分別檢測(cè)偶聯(lián)抗-OX40/抗-AFP-納米微粒對(duì)CTL細(xì)胞增殖作用影響，以及細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2和IFN-γ含量。4. LDH方法檢測(cè)抗-OX40/抗-AFP-納米微粒對(duì)CTL抗肝癌作用的殺傷效率。
　　結(jié)果：1.在掃描電鏡下觀察制備的 PLGA納米微粒，形貌為大小較

3、均勻的圓形顆粒，平均粒徑大小在396nm，粒徑分布窄。Zetasizer檢測(cè)PLGA納米微粒Zeta電位為-(35.12±5.34)mV。使用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定 PLGA納米微粒的載藥量和包封率分別為（0.702±0.073）％、（16.7±0.17）%。2.用CD14+能成功誘導(dǎo)DC細(xì)胞，并且通過VarioMACS系統(tǒng)能獲得較高純度的CD8+細(xì)胞。3.偶聯(lián)抗-OX40抗體/抗-AFP抗體的PLGA納米粒子能有效誘導(dǎo)CTL細(xì)胞的增殖活

4、化，增殖指數(shù)為(151.49±16.25)%，CTL所產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ分別為（130.53±37.058）pg/ml、（265.37±17.05）pg/ml。4.在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞膜染色的CTL和HepG2，加入抗-OX40/抗-AFP-納米微粒中，CTL細(xì)胞與HepG2細(xì)胞兩種細(xì)胞直接結(jié)合緊密，相同細(xì)胞比例中，加入抗-OX40/抗-AFP-納米微粒的細(xì)胞結(jié)合的更加緊密，結(jié)合細(xì)胞數(shù)也更多。LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入抗-OX4