內(nèi)源性載脂蛋白O對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能的影響及機(jī)制初探.pdf

1、背景：
　　載脂蛋白O（apolipoprotein O，apoO）是2006年新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，目前對(duì)其生理功能的認(rèn)識(shí)知之甚少。生理情況下apoO的平均血漿濃度極低，僅為2.21±0.83μg/ml。即使分泌型apoO主要存在于高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）中，但apoO與HDL膽固醇水平及其他血脂成分并無(wú)相關(guān)性，且過(guò)表達(dá)apoO也不影響HDL的質(zhì)量和功能，提示分泌到血漿中的apoO

2、作用十分有限。
　　除作為分泌型蛋白在細(xì)胞外發(fā)揮作用，apoO還可滯留于細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者apoO的血漿濃度明顯升高，并且與炎癥指標(biāo)高敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）水平呈顯著正相關(guān)性，由此推測(cè)apoO可能與機(jī)體炎癥狀態(tài)有關(guān)。與此一致的是，采用小RNA干擾（small interferi

3、ng RNA，siRNA）技術(shù)沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)后，多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)明顯改變，但apoO是否在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答的作用及可能的調(diào)節(jié)途徑均尚屬未知?；谥炯?xì)胞可大量合成apoO，而脂肪細(xì)胞炎癥激活所致分泌功能異常在肥胖及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，深入探討內(nèi)源性apoO對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能的影響，對(duì)揭示apoO的生理功能以及肥胖等相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
　　目的：
　　探討內(nèi)源性apoO是否

4、參與調(diào)控脂肪細(xì)胞炎癥應(yīng)答，以及apoO影響脂肪細(xì)胞分泌功能的可能作用機(jī)制。
　　方法
　　一.載脂蛋白O對(duì)人脂肪細(xì)胞分泌功能的影響
　　由行腹部外科手術(shù)的患者少許皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)得人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)，繼而誘導(dǎo)分化為成熟的人脂肪細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)及油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞。構(gòu)建含人apoO-siRNA的慢病毒表達(dá)載體并包

5、裝好后，以低濃度氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein，ox-LDL)(12.5μg/ml)分別干預(yù)正常人脂肪細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了apoO-siRNA慢病毒顆粒的脂肪細(xì)胞，采用real-time PCR檢測(cè)apoO、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、單核趨化蛋白-1(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor n

6、ecrosisfactor-α，TNF-α)mRNA水平;western blot法檢測(cè)apoO蛋白表達(dá);ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液炎性細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白水平。
　　二.載脂蛋白O調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌功能的可能作用機(jī)制
　　人ADSCs以促分化液促分化14天，或于促分化第4天行慢病毒轉(zhuǎn)染沉默apoO表達(dá)并繼續(xù)誘導(dǎo)分化成熟后，以低濃度ox-LDL(12.5μg/ml)分別干預(yù)上述兩種脂肪細(xì)胞，real-t

7、ime PCR檢測(cè)Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiationprimary response protein88，MyD88）、白介素-1受體相關(guān)激酶4(IL-1receptor-associated kinase4，IARK4)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）mRNA水平

8、變化;westernblot法檢測(cè)TLR4、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclearfactor-κB-α， IκBα)及磷酸化IκBα（phosphorylated IκBα，Phospho-IκBα）的表達(dá)情況。
　　三.載脂蛋白O調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路方式的探討
　　促分化成熟的人脂肪細(xì)胞用低濃度 ox-LDL（12.5μg/ml）干預(yù)24小時(shí)，對(duì)比觀察刺激前后如下情況:①免疫熒光法觀察

9、apoO在脂肪細(xì)胞內(nèi)的定位;激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)apoO與caveolin-1的分布關(guān)系;②蔗糖密度梯度離心法處理細(xì)胞，觀察apoO在小凹區(qū)域的分布;③免疫共沉淀法檢測(cè)apoO與caveolin-1是否存在互相作用。另于誘導(dǎo)分化第4天行慢病毒轉(zhuǎn)染沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)并繼續(xù)誘導(dǎo)分化至成熟后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化。
　　結(jié)果：
　　一.載脂蛋白O對(duì)人脂肪細(xì)胞分泌功能的影響
　　1.成功提取人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)分

10、化為成熟的人脂肪細(xì)胞;
　　2.構(gòu)建的apoO-siRNA慢病毒顆粒能有效抑制人脂肪細(xì)胞中apoO mRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.005);
　　3.與對(duì)照組相比，低濃度ox-LDL刺激后，人脂肪細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)增加并伴促炎細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、TNF-αt合成減少(P＜0.01);
　　4.有效沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)后，低濃度ox-LDL刺激可明顯增加IL-6、MCP-1、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的合成與分

11、泌(P＜0.01)。
　　二.載脂蛋白O調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌功能的可能作用機(jī)制
　　1.與對(duì)照組相比，低濃度ox-LDL刺激后，人脂肪細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.05);
　　2.低濃度ox-LDL刺激人脂肪細(xì)胞可明顯抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路活性(P＜0.05);
　　3.有效沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)后，低濃度ox-LDL刺激可激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路(P＜0.05)。
　　三.載脂蛋白

12、O調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路方式的探討
　　1.基礎(chǔ)狀態(tài)下，人脂肪細(xì)胞內(nèi)apoO定位于胞漿脂滴膜上;低濃度ox-LDL刺激后，apoO可移至胞膜小凹區(qū)域與caveolin-1共定位;
　　2.免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，apoO與caveolin-1可發(fā)生相互作用;
　　3.有效沉默apoO表達(dá)后，脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)源性apoO介導(dǎo)了低濃度ox-LDL對(duì)脂