重組雙自殺基因腺病毒Ad-Cp-CDglyTK靶向治療鼻咽癌的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌是華南地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤，放療是目前首選的治療方法，近年單純放療5年生存率一直徘徊在50-60﹪之間，早期效果較好，中晚期效果明顯降低，第二次放療僅25﹪患者有效，5年生存率下降為12～23﹪，且放射損害性大，第三次放療則基本無效，因此許多腫瘤學家致力于尋找有效的化療方案，但研究結果并不一致，腫瘤局部復發(fā)與遠處轉移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因，因此探尋更有效的治療方法仍是目前鼻咽癌研究的重點與熱點。 腫瘤基因治療成為近

2、20年來的熱點，許多基因治療方案也從實驗室進入臨床實驗階段。自殺基因療法是其中研究比較多的一種腫瘤基因療法，其原理是將一些病毒或細菌基因組中的前藥轉換酶基因導入腫瘤細胞，這種基因可以編碼特殊的酶，將原先無毒性的前藥在腫瘤細胞中代謝為毒性產物，從而達到殺死腫瘤細胞的目的，由于腫瘤自殺基因治療療效確切，一些研究已進入臨床Ⅱ/Ⅲ期階段。 Epstein-Barr病毒(EBV)和NPC有著密切的關系，在EBV誘導NPC細胞所表達的特異性

3、抗原中，核抗原1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)是唯一在潛伏感染和裂解性感染時都表達的核蛋白，其生理作用是維持潛伏感染時EBV拷貝數(shù)的穩(wěn)定，并有利于EBV在宿主細胞中的免疫逃逸。Cp是負責EBNA1基因轉錄的一個啟動子，其DNA序列存在多個EBNA1基因表達的調控位點，因此我們在本研究中采用Cp的-248bp至+76bp序列作為自殺基因的特異性啟動子，構建CD-TK雙自殺基因靶向腺病毒載體Ad

4、-Cp-CDglyTK，探討Cp啟動子能否特異性調控自殺基因在轉染鼻咽癌細胞中表達，從而達到靶向性治療鼻咽癌的目的。 第1章重組腺病毒質粒pDC316-Cp-CDglyTK構建高保真PCR(polymerase chain reaction)擴增tk基因，回收PCR產物并用HindⅢ+SalⅠ進行酶切，再回收產物，同時采用HindⅢ+SalⅠ酶切穿梭質粒pDC3 16，回收線性化載體片段，T<,4>DNA連接酶進行連接反應，連

5、接產物轉化大腸桿菌E.coliDH5 α，挑取克隆，抽提質粒DNA，得到重組質粒pDC316-TK，再用EcoRI+HindⅢ酶切所構建質粒，回收線性化質粒片段。同時高保真PCR擴增cd基因，回收并用HindⅢ+EcoRⅠ酶切，回收片段，與pDC316-TK酶切線性化片段經過連接、轉化、篩選等方法得到重組質粒pDC316-CDglyTK，XbaⅠ+EcoRⅠ酶切質粒，回收線性化片段以備用。另外，高保真PCR擴增Cp啟動子，XbaⅠ+Ec

6、oRⅠ酶切PCR產物，回收產物，與pDC316-CDglyTK酶切片段經過連接、轉化、篩選等方法到重組質粒pDC316-Cp-CDglyTK。重組質粒經過PCR電泳、酶切電泳法及DNA測序法等證明tk、cd、cp基因序列插入方向正確。 第2章重組腺病毒AdCp-CDglyTK包裝純化當HEK293細胞長至80～90﹪融合時，取骨架質粒pBHGlox(delta)E1、E3Cre和質粒pDC316-CP-CDglyTK，用Lip

7、ofectamine2000脂質體進行轉染293細胞，2h后換成含5﹪的培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14天至出現(xiàn)細胞病變效應(CPE)，收集病變細胞，37℃、-70℃反復凍融3次，取1/3病毒上清液再感染293細胞進行大量擴增，3天后收集細胞，PBS重懸，反復凍融3次，最后CsC1梯度離心純化，-80℃保存?zhèn)溆?。擴增后的病毒滴度采用快速腺病毒滴度TCID50檢測試劑盒進行測定，病毒滴度為5.6×10<'9>TCID50/ml。 第3章逆轉

8、錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CDglyTK基因體外表達CNE1、NP69細胞于對數(shù)生長期分別加入病毒載體(MOI為100∶1)，感染2h，吸去上清，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞，抽提細胞總RNA，兩組細胞各取總RNA1μg于20μl逆轉錄體系中合成cDNA，各組取cDNA模板2μl在25μl體系中進行PCR反應。上游引物序列為5’-tgacttactggcaggtgctg-3’，下游引物：5’-atgetgcccataag

9、gtatcg-3’，預期擴增針對tk基因的約300bp片段。PCR產物進行2﹪瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR結果示鼻咽癌細胞轉染電泳圖中300bp處為預期條帶，證明CNE1細胞內成功轉入融合基因，而NP69細胞株未表達Cp-CD-TK基因。 第4章 MTT法觀察Ad-Cp-CDglyTK/5-FC+GCV體外抑制CNE細胞作用CNE1細胞株實驗共分GCV、5-FC、GCV+5-FC三組，GCV的終濃度分別為2、10、25、50、7

10、5、100、200μg/ml，5-FC的終濃度分為20、50、100、200、400、800、1600μg/ml， NP69細胞株作為對照組，只采用GCV+5-FC聯(lián)合用藥方式，GCV、5-FC終濃度同上。 取對數(shù)生長期CNE1細胞進行消化計數(shù)，按3000個細胞/孔接種于含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔培養(yǎng)板中，NP69細胞則采用Keratinocyte-SFM無血清培養(yǎng)液，于37℃、含5﹪CO<,2>的條件下

11、培養(yǎng)，鏡下觀察細胞生長到80﹪的融合度時，病毒原液用相應的培養(yǎng)液稀釋后(MOI為100)感染細胞，24小時后按上述設計方案分別給予GCV、5-FC前體藥進行處理，每孔總量為200μl，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，提前4 h每孔加入10μl 10mg/ml MTT溶液，吸去上清，每孔加入150μlDMSO液，震蕩5min，待藍色溶解后，測定各孔0.D<,570>值，計算相對抑制率后繪制劑量-效應曲線，數(shù)據用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組問數(shù)

12、據比較采用x<'2>檢驗。 結果：重組腺病毒感染CNE1與NP69細胞株后，單獨GCV、5-FC給藥組對CNE1都具有較高的抑制作用，但兩者之間未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.1)，聯(lián)合用藥組對CNE1的抑制作用最強，與單獨用藥有明顯統(tǒng)計差異(P<0.05)，NP69細胞株對GCV+5-FC聯(lián)合用藥未表現(xiàn)出明顯的敏感性，與其他三組也有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 結論：Cp啟動子可以特異性調控CDglyTK融合自殺基因