HCMV經(jīng)TGFβ-Smad信號(hào)通路對(duì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞Smad4表達(dá)影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)體外感染絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT) Smad4表達(dá)水平的變化的研究，初步探究該病毒經(jīng)TGFβ/Smad信號(hào)通路對(duì)EVT功能的影響。
　　方法:
　　1、采用復(fù)合酶梯度離心法培養(yǎng)原代EVT，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CK7、c-erbB-2、Vim等蛋白信號(hào)以鑒定細(xì)胞來(lái)源及純度。
　　2、培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC5以擴(kuò)增HCMV AD169實(shí)驗(yàn)株，并用Reed-Muenc

2、h法測(cè)其病毒半數(shù)細(xì)胞感染量TCID50。
　　3、EVT被HCMV感染后，通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)HCMVpp65抗原，判斷EVT病毒感染情況。
　　4、MTT法檢測(cè)并篩選HCMV對(duì)EVT細(xì)胞體外增殖影響的最小病毒劑量及后續(xù)試驗(yàn)的最佳病毒接種量。
　　5、實(shí)驗(yàn)分為正常組(EVT)和病毒組(EVT+HCMV)，HCMV接種至EVT細(xì)胞48h后，利用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot方

3、法檢測(cè)各組細(xì)胞Smad4表達(dá)的水平。
　　6、利用體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，研究HCMV感染EVT細(xì)胞后，對(duì)EVT體外侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1、約95％分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)CK7和c-erbB-2表達(dá)，Vim偶見(jiàn)表達(dá)，提示絨毛組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞為高純度的EVT。
　　2、病毒HCMV AD169株測(cè)定的TCID50為10-4.21/0.1ml，即將HCMV AD169病毒稀釋104.21接種100ul可

4、使50％的細(xì)胞發(fā)生病變。
　　3、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，EVT胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量HCMVpp65抗原熒光信號(hào)。
　　4、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，HCMV感染48h后，30ul、40ul、50ul病毒液對(duì)EVT增殖抑制作用明顯（P＜0.05），各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故最佳病毒接種劑量為30ul100TCID50HCMV/120ul培養(yǎng)基。
　　5、QT-PCR結(jié)果提示，正常組和病毒組中均有

5、TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、MMP2、MMP9mRNA表達(dá)。TGF-β1 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.050和1.246±0.045，TβRImRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.001±0.052和1.317±0.051，TβRⅡ mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.001±0.052和1.296±0.114，Smad2 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.000

6、±0.033和1.380±0.064，Smad4 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.052和1.36±0.080， Smad7 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.317±0.051和1.001±0.052，MMP2 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.037和0.912±0.016，MMP9 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.037和0.909±0.025，Smad1 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分

7、別為1.000±0.120和1.040±0.040，Smad5 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.010±0.130和1.100±0.160，Smad6 mRNA在兩組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.010±0.130和0.840±0.040。與正常組比較，病毒組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Smad7、MMP2、MMP9mRNA表達(dá)相對(duì)降低，

8、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組EVT中Smad1、Smad5、Smad6mRNA表達(dá)無(wú)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6、免疫細(xì)胞熒光染色顯示，Smad4蛋白在正常組和病毒組EVT中均表達(dá)，其在兩組中的平均光密度(AOD)分別為0.376±0.044和0.530±0.086。與正常組比較，病毒組EVT中Smad4蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7、Western Blot實(shí)

9、驗(yàn)所測(cè)定的結(jié)果提示，Smad4蛋白在正常組和病毒組細(xì)胞中均表達(dá)，且在兩組中Smad4蛋白表達(dá)的灰度值(GDR)分別為0.518±0.053和0.884±0.093，與正常組比較，病毒組中Smad4蛋白表達(dá)水平增高明顯(P＜0.05)。
　　8、體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提示，正常組和病毒組EVT均可穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠，其兩組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（56.1±3.06）個(gè)和(45.7±2.73)個(gè)(P＜0.05)，提示HCMV抑制EVT侵襲

10、活力。
　　結(jié)論:
　　1、HCMV在體外可能通過(guò)TGF-β/Smads信號(hào)通路來(lái)抑制原代EVT細(xì)胞的增殖及其侵襲，并能使細(xì)胞中Smad4基因表達(dá)水平增高。
　　2、Smad4可能在HCMV宮內(nèi)感染導(dǎo)致異常妊娠的機(jī)制中起重要作用，其機(jī)制可能是HCMV損傷EVT，正性調(diào)控信號(hào)通路TGF-β族配體→受體→Smad蛋白→轉(zhuǎn)錄因子→DNA，促進(jìn)Smad4表達(dá)，最終導(dǎo)致EVT侵潤(rùn)能力不足，胚胎著床太淺，導(dǎo)致流產(chǎn)等異常妊娠的發(fā)生。