大鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向軟骨表型分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 探討從大鼠的脂肪組織中分離、培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的方法及鑒定方法。并對(duì)在單層培養(yǎng)條件下用外源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1定向誘導(dǎo)ADSCs分化為軟骨細(xì)胞的可行性進(jìn)行初步的探討研究。為軟骨組織工程研究中的種子細(xì)胞的選擇提供一個(gè)新的思路。 實(shí)驗(yàn)方法: Wistar雄性大鼠處死，取腹股溝區(qū)及睪丸脂肪墊等處脂肪組織，清除小血管和結(jié)締組織充分剪碎，加入0.15％的Ⅰ型膠原酶消化，離心后收集細(xì)胞置于孵箱中培

2、養(yǎng)。2-3天換液一次去除未貼壁細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80-90％時(shí)傳代培養(yǎng)。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察各代ADSCs形態(tài)學(xué)的改變，并用免疫熒光法檢測(cè)傳代ADSCs表面抗原CD29表達(dá)。取第3代生長(zhǎng)良好的脂肪干細(xì)胞，分成兩組：一組用含有TGF-β1的培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，另一組為對(duì)照組(空白組)用普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)兩周后行ⅠⅠ型膠原免疫組化染色進(jìn)行檢測(cè)鑒定。 結(jié)果: 1、脂肪干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)：原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞24小

3、時(shí)左右即可見細(xì)胞貼壁，多數(shù)貼壁細(xì)胞呈小圓形，折光性強(qiáng)，其中散在少量的梭形細(xì)胞或多角細(xì)胞。3d后梭形細(xì)胞逐漸增多，可見核分裂相。5d后細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，并形成集落。約7d左右細(xì)胞融合超過90％時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，呈長(zhǎng)梭形，排列緊密，類似成纖維細(xì)胞。 2、脂肪干細(xì)胞的鑒定：免疫熒光法檢測(cè)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)。結(jié)果顯示細(xì)胞表面抗原CD29呈陽(yáng)性表達(dá)，從而證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為干細(xì)胞來源。 3、ADSCs向軟骨細(xì)胞

4、的定向分化：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，誘導(dǎo)第2天即可見少數(shù)單個(gè)細(xì)胞由梭形變?yōu)槎噙呅?，多角形，可見?xì)長(zhǎng)偽足，核周出現(xiàn)黑色顆粒，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生如前變化的細(xì)胞逐漸增多。誘導(dǎo)第14天左右部分細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞邊界不清，核略呈偏位，核周顆粒密集，細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)。 4、誘導(dǎo)后細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)組在TGF-β1向軟骨表型定向誘導(dǎo)后14d，Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示有部分細(xì)胞呈陽(yáng)性，可見棕黃色顆粒分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)而對(duì)照組