中藥單體蟾毒靈對人肝癌細胞HepG2的抑制作用及其機制研究.pdf

1、一、研究背景:肝癌是世界第五大癌癥,每年有上百萬人死于肝癌,世界范圍內(nèi)每年的新發(fā)病例數(shù)約為550000,占人類癌癥的5％,占癌癥死亡率的第三位。目前對肝癌的主要治療方法是進行手術(shù)治療(切除或移植),但大多數(shù)肝癌病人發(fā)現(xiàn)已屬晚期,并不符合手術(shù)治療條件,并且手術(shù)治療后面臨術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的問題。我國是肝癌高發(fā)地區(qū),中藥用于治療腫瘤的歷史悠久,并已取得顯著的效果,中藥單體的分離以及藥理作用研究是目前研究中藥的一個重要途徑.蟾毒靈(bufalin

2、)是從中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一,分子式為C24H32O4,相對分子質(zhì)量為386.5,已有研究表明蟾毒靈是一種Na+-K+-ATPP酶抑制劑,屬蟾酥二烯羥酸內(nèi)酯單體之一,因其結(jié)構(gòu)與洋地黃類似,也被歸為強心類固醇類。文獻報道能夠抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性,干擾細胞DNA復(fù)制,早期多數(shù)研究集中在對誘導(dǎo)人類白血病分化和凋亡方面,近年來有研究表明蟾毒靈可以抑制子宮內(nèi)膜異位細胞以及卵巢癌、前列腺癌等的生長,促進細胞凋亡。源于華蟾素藥物在本科室臨

3、床治療肝癌的有效應(yīng)用以及前期的相關(guān)工作基礎(chǔ)提示蟾毒靈單體能夠抑制人肝癌細胞的生長,本課題選用國內(nèi)外研究人肝癌細胞應(yīng)用較為廣泛的細胞株HepG2,研究了蟾毒靈單體對人肝癌細胞生長的抑制作用并探討了其部分相關(guān)機制。 二、研究目的: 1.體外觀察蟾毒靈抑制肝癌細胞株HepG2生長的作用,明確量效關(guān)系,選擇一個最小有效劑量和時間為后期機制研究作參考。 2.明確蟾毒靈對細胞周期分布的影響,在細胞周期改變的基礎(chǔ)上,進一步研究

4、蟾毒靈對細胞周期相關(guān)蛋白以及周期蛋白依賴性激酶的改變情況。 3.明確蟾毒靈對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用,并且明確蟾毒靈對凋亡相關(guān)蛋白bc1-2及bax的影響以及在其誘導(dǎo)凋亡的同時有哪些主要信號通路發(fā)生了變化。 4.為臨床應(yīng)用蟾毒靈治療HCC提供科學的實驗依據(jù)。 三、研究方法: 1.MTT法測定不同濃度(0.128、0.64、3.2、16、80、400、2000、10000nM)的蟾毒靈單體作用不同時間(24h、4

5、8h、72h)對肝癌細胞細胞株HepG2的生長抑制作用。 2.流式細胞儀(FCM)采用PI染色及Rnase消化方法檢測不同濃度蟾毒靈分別作用-24h及48h對HepG2細胞周期分布的影響；進一步選擇周期阻滯最明顯的劑量80nM蟾毒靈,觀察其在24h內(nèi)作用不同時間對HepG2細胞周期分布的影響；并且初步根據(jù)細胞周期亞二倍體峰或稱亞G1峰來判斷蟾毒靈對細胞凋亡的誘導(dǎo)情況。 3.采用AnnexinV/PI凋亡試劑盒通過FCM分

6、析檢測蟾毒靈誘導(dǎo)細胞凋亡的情況。選擇80nM、400nM、2μM濃度作用不同時間(24、48、72小時),觀察是否具有濃度以及時間依賴性。 4.基于對細胞周期阻滯以及凋亡誘導(dǎo)的確定性判斷,采用Western blot方法檢測蟾毒靈作用后細胞周期相關(guān)蛋白以及激酶的改變,檢測主要促凋亡以及抑制凋亡的蛋白以及信號通路的改變情況。 5.RT-PCR檢測蟾毒靈對細胞內(nèi)Bcl-2及Bax的mRNA水平的影響。 四、研究結(jié)果:

7、 1.MTT結(jié)果顯示,蟾毒靈對HepG2細胞的生長抑制作用呈時間依賴性和劑量依賴性。其24h、48h和72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為102±5.231nM、83±3.142nM和67±3.356nM。 2.蟾毒靈作用于HepG2,在80nM濃度內(nèi)隨濃度增加G2/M期比例明顯增加,其他兩期比例減少,作用到24h G2/M期比例增加至68％,濃度或時間繼續(xù)增加G2/M比例逐漸減少,凋亡比例開始增加；G2/M作用24h

8、內(nèi)隨時間增加G2/M比例逐漸增加,撤銷藥物后細胞周期阻滯情況不可逆。 3.蟾毒靈在400HM以上濃度能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡,隨時間及劑量的增加凋亡細胞比例逐漸增加,呈時間劑量依賴性(24h、48h、72h),撤銷藥物后凋亡不可逆。 4.Western blot檢測顯示804濃度蟾毒靈作用6h G2/M期調(diào)控蛋白cyelinB1開始下降,24h內(nèi)隨時間增加逐漸下調(diào),對CDK1沒有明顯的改變：400nm蟾毒靈作用后

9、隨時間增加能夠下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA水平及其蛋白的表達,同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax mRNA水平及其蛋白的表達；400nm蟾毒靈作用3h后隨時間增加AKT信號通路的活化受到抑制、JNK姒PK信號通路的活化增加。 五、研究結(jié)論: 1.蟾毒靈單體能夠抑制HepG2細胞的生長,且抑制作用呈時間依賴性和劑量依賴性。 2.蟾毒靈單體能夠下調(diào)cyclinBl的表達,使其不能與CDK1形成有效的MPF復(fù)合物,從而使