抗癌扶正方及拆方抗肝癌有效成分的篩選及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的： 篩選抗癌扶正方有效抗肝癌的藥效簡(jiǎn)方。體內(nèi)外評(píng)價(jià)抗癌扶正方及拆方抗癌與扶正兩類(lèi)藥物組的抗肝癌活性，篩選其抗肝癌功效的主要藥物及有效成分，精簡(jiǎn)臨床有效驗(yàn)方。 研究方法： 建立肝癌小鼠H22腹水移植瘤模型，并隨機(jī)分為模型組，5-FU陽(yáng)性對(duì)照組，抗癌扶正方高、中、低劑量組，抗癌方高、中、低劑量組及扶正方高、中、低劑量組。接種次日開(kāi)始，每日按組分別予全方高、中、低劑量、抗癌方和扶正方高、中、低劑量水煎液灌胃。配

2、制的抗癌扶正方及據(jù)功效拆分抗癌方和扶正方藥物溶液劑量如下：ALC全方依次為0.92g/ml、0.46g/ml、0.23 g/ml；抗癌方依次為0.58g/ml、0.29g/ml、0.15g/ml；扶正方依次為0.32g/ml、0.16g/ml、0.08g/ml，每只小鼠每日0.4ml灌胃。模型組小鼠每日0.4ml生理鹽水灌胃；5-FU陽(yáng)性對(duì)照組小鼠按182mg/kg劑量，每日0.4ml灌胃。給藥7日后處死小鼠，剝離腫瘤和脾臟并稱重，計(jì)算

3、各組藥物的抑瘤率和小鼠脾指數(shù)。將各組小鼠實(shí)體瘤標(biāo)本包埋、切片并HE染色，顯微鏡鏡下比較壞死面積百分率。ELISA法檢測(cè)小鼠肝癌實(shí)體瘤組織中細(xì)胞壞死因子TNF-α水平和端粒酶活性。體外研究以氟尿嘧啶5-FU陽(yáng)性對(duì)照，抗癌扶正方以及拆方的抗癌方和扶正方為實(shí)驗(yàn)組，三方均設(shè)1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1mg/ml、10mg/ml、100mg/ml六個(gè)劑量組，采用MTT噻唑氮藍(lán)比色法觀察各組不同劑量的藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-

4、7721增殖的影響；篩選MTT有效劑量的藥物作用細(xì)胞24小時(shí)后，以Hoechst33258熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；采用流式細(xì)胞儀FCM檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期分布，以及對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721中p53、bcl-2凋亡調(diào)控基因蛋白表達(dá)的影響。 研究結(jié)果： 抗癌扶正方ALC及拆方對(duì)小鼠H22肝癌均有一定抑制，各劑量組小鼠肝癌瘤重均明顯小于模型組（p<0.01）。ALC高劑量組抑瘤率達(dá)

5、76.73％，中劑量組抑瘤率與5-FU陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。抗癌方的抑瘤作用與ALC全方相當(dāng)（P>0.05），明顯強(qiáng)于扶正方（p<0.05）?？拱┓稣揭约翱拱┓健⒎稣骄商岣咝∈笃⒅笖?shù)，明顯高于5-FU組（p<0.05），與正常空白組小鼠水平接近（p>0.05）。用藥組小鼠肝癌瘤組織HE染色后，鏡下均可見(jiàn)不同面積的壞死灶，其中抗癌方高劑量組壞死面積最大。ELISA法測(cè)小鼠肝癌實(shí)體瘤TNF-α水平和端粒酶活性的結(jié)果顯示

6、：抗癌扶正方及拆方組小鼠肝癌TNF-α水平較模型組小鼠有顯著提高（p<0.05）；端粒酶活性較模型組，則顯著下降（p<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中，抗癌扶正方全方及抗癌方組藥物的MTT結(jié)果顯示：100μg/ml劑量對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)于加藥后24小時(shí)均有明顯抑制（p<0.01），組間差異無(wú)顯著性（p>0.05），而100μg/ml48小時(shí)組的細(xì)胞抑制率與24小時(shí)組相比，未有明顯提高。10mg/ml劑量組扶正方對(duì)細(xì)胞的抑制顯著（p

7、<0.01），但較ALC全方及抗癌方，均差異顯著（p<0.01）。抗癌方中莪術(shù)油組分24小時(shí)10mg/ml劑量的抑制率，顯著高于同劑量的全方當(dāng)歸+莪術(shù)油以及扶正當(dāng)歸油組（p<0.01）；而抗癌方多糖組抑制率較扶正方多糖組，有明顯提高（p<0.01）。合用抗癌方中莪術(shù)油和抗癌方中多糖組分后，抑制率均高于單用莪術(shù)油和單用多糖組，差異均有顯著性（p<0.01）。熒光顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)Hoechst33258染色的各組用藥組肝癌細(xì)胞，均出現(xiàn)少量核固

8、縮或核碎裂，ALC及拆方的高劑量組出現(xiàn)典型凋亡小體。流式細(xì)胞儀FCM分析抗癌扶正方及拆方作用24小時(shí)的肝癌細(xì)胞，DNA直方圖顯示1mg/ml藥物作用下即出現(xiàn)明顯“亞G1峰”，即凋亡峰Ap，且凋亡量效關(guān)系明顯（p<0.01）。其中抗癌方1mg/ml凋亡率與全方接近，10mg/ml顯著大于全方（p<0.01）。細(xì)胞周期顯示：較于空白對(duì)照組，G0/G1期比例相對(duì)增加，S期及G2/M期比例相對(duì)下降，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期。ALC作用細(xì)胞2

9、4小時(shí)，流式細(xì)胞儀FCM檢測(cè)凋亡調(diào)控基因蛋白表達(dá)的結(jié)果表明：隨著ALC及拆方用藥濃度增加，肝癌細(xì)胞SMMC-7721中mtp53和bcl-2蛋白表達(dá)均不同程度的減弱。其中全方組與抗癌方、扶正方表達(dá)的RFI差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。 研究結(jié)論： 抗癌扶正方及拆方均能夠明顯抑制小鼠肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)，其中抗癌方與全方效果接近，可能是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ALC全方抗肝癌的主要功效簡(jiǎn)方。抗癌扶正方及拆方均能提高小鼠機(jī)體免疫

10、水平，且不同程度的抑制了小鼠肝癌端粒酶活性、提高肝癌組織中TNF-α水平?？拱┓稣郊安鸱接行Э垢伟C(jī)制，可能與其提高機(jī)體免疫水平，抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性以及提高肝癌組織TNF-α水平有關(guān)?？拱┓稣郊安鸱皆隗w外亦能明顯抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。其中，抗癌方的抑制效果與全方接近，優(yōu)于扶正方?？拱┓稣紸LC抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制，可能與其阻滯細(xì)胞周期，下調(diào)細(xì)胞中mt