阿托伐他汀對(duì)脂多糖刺激下外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是通過(guò)脂質(zhì)的累積、平滑肌細(xì)胞的增殖和鈣化而引起的一種動(dòng)脈損傷為特征的疾病，血漿總膽固醇水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的主要危險(xiǎn)因素，低密度脂蛋白（LDL）尤其是LDL亞型中的小而致密的低密度脂蛋白是AS的重要致病因素。LDL經(jīng)氧化修飾而生成的氧化LDL（OX-LDL）是損傷內(nèi)皮細(xì)胞及其下的平滑肌細(xì)胞的主要原因。大量研究結(jié)果已充分表明，血漿TC或LDL-C水平升高在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著很重要的作用，與人群中冠心病

2、的患病率和死亡率呈顯著的正相關(guān)；血漿HDL-C水平低下已被公認(rèn)為是冠心病的危險(xiǎn)因素；血漿甘油三酯濃度升高也逐漸被認(rèn)為是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。人體內(nèi)的總膽固醇（TC）1/3來(lái)源于食物，2/3由肝臟合成，肝臟合成膽固醇需要經(jīng)歷3個(gè)階段25個(gè)步驟，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶是肝臟生物合成膽固醇的限速酶，其活性受體內(nèi)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)，當(dāng)體內(nèi)膽固醇排空時(shí)，其活性增強(qiáng)而促使膽固醇合成，而當(dāng)膽固醇合成或攝入增加時(shí)，其活性降低，

3、負(fù)反饋使膽固醇生物合成減少，HMG-CoA還原酶抑制劑（他?。貶MG-CoA還原酶抑制劑，其作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA還原酶，使其活性顯著降低，肝內(nèi)膽固醇合成量驟減，結(jié)果使血膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平降低，中度降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平，且增加肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體濃度，降低LDL-C能力，在臨床上對(duì)高脂血癥特別是對(duì)中、高度高膽固醇血癥療效顯著，是目前預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的首選藥物。他汀類(lèi)

4、藥物的應(yīng)用顯著降低了動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的發(fā)病率及病死率。 近年來(lái)隨著研究的深入，臨床研究和藥物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了他汀類(lèi)藥物還具有降脂以外的治療作用，血管內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化早期形成的始動(dòng)因素，他汀類(lèi)藥物可在短期內(nèi)使血流介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能明顯迅速改善，其機(jī)制是動(dòng)員骨髓內(nèi)皮原組細(xì)胞入血并粘附于受損部位，另外，還通過(guò)改善一氧化氮合成酶（eNOS）活性使NO水平增加，血管擴(kuò)張。他汀類(lèi)藥物可以減輕“犯罪”血管病變部位的

5、炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣硬化斑塊，此處所說(shuō)的炎癥包括物理性、化學(xué)性和感染性。炎癥細(xì)胞可產(chǎn)生粘附分子、白介素、細(xì)胞因子等，對(duì)細(xì)胞增殖、脂質(zhì)沉積和形成不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊起了重要作用。C-反應(yīng)蛋白（CRP）是炎癥標(biāo)志物，其水平增高可作為預(yù)測(cè)冠心病患者發(fā)生冠脈事件的標(biāo)志之一，他汀可以降低C-反應(yīng)蛋白（CRP），并且此作用獨(dú)立于LDL-C水平及多種危險(xiǎn)因素，此外研究還發(fā)現(xiàn)他汀可以下調(diào)可溶性黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E選擇素、P選擇素的水平，通

6、過(guò)抑制組織因子、纖溶酶原激活物抑制劑-1表達(dá)、凝血酶的生成及血小板的活化發(fā)揮抗凝作用，等等，通過(guò)這些機(jī)制他汀類(lèi)藥物發(fā)揮了改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊，抗炎、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)等多方面的功能，他汀類(lèi)藥物治療作用的“多效性”日益受到人們的重視，甚至于他汀類(lèi)藥物的應(yīng)用也突破主要治療冠心病、高脂血癥的局限，開(kāi)始應(yīng)用于心力衰竭、腎功能不全、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，在臨床上取得了不錯(cuò)的效果。 目前對(duì)他汀類(lèi)藥物作用機(jī)制的研究大多通過(guò)人體內(nèi)或動(dòng)物

7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)展開(kāi)，臨床病人口服他汀類(lèi)藥物或者是動(dòng)物經(jīng)消化道給藥，在不同的時(shí)間點(diǎn)抽出人體或動(dòng)物血標(biāo)本，通過(guò)各種不同技術(shù)檢測(cè)研究設(shè)定的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，從而探索他汀類(lèi)藥物的可能作用。本研究試圖從體外細(xì)胞培養(yǎng)的角度，來(lái)研究他汀藥物的作用，相對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果更為直觀，可能具有更好的說(shuō)服力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)感染引起的炎癥也參與了冠心病的發(fā)生及發(fā)病。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜中活性成分?？纱碳C(jī)體防御系統(tǒng)過(guò)度釋放炎性因子、包

8、括腫瘤壞死因子（TNF）、白介素（IL）及一氧化氮（NO）等。故本實(shí)驗(yàn)，以脂多糖刺激外周血單核細(xì)胞，再以阿托伐他汀加以干預(yù)，比較干預(yù)前后TNF-α、IL-1β的分泌量，探討阿托伐他汀在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中的作用，同時(shí)從感染的角度探討他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。 目的： 觀察阿托伐他汀對(duì)脂多糖（LPS）刺激下外周血單核細(xì)胞（PBMC）分泌TNF-α、IL-1β的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于加深他汀類(lèi)藥物抗炎、免疫調(diào)節(jié)等非降脂作用的認(rèn)識(shí)

9、，同時(shí)從感染的角度探討他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。 材料和方法： 1.材料： 研究對(duì)象：外周血單核細(xì)胞 2.研究方法： 2.1主要溶液的配制 （1）阿托伐他汀溶液配制： 阿托伐他汀原料藥60.47mg，溶于1ml無(wú)水乙醇，加入0.1mol/LNaOH1.5ml，55℃水浴鍋中靜置2h，以0.1mmol/L HCl調(diào)pH至7.2，加PBS至總體積5ml，過(guò)濾后分裝，-70℃凍存，貯存濃度

10、為10mmol/L （2）脂多糖溶液的配制： 在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，脂多糖100mg，加入1mlDMSO輔助其溶解，吸取0.5ml溶入無(wú)菌蒸餾水中，總體積50ml，待其完全溶解后過(guò)濾后分裝，-70℃凍存。 2.2 PBMC分離、培養(yǎng)： 空腹、無(wú)菌條件下抽取健康人外周靜脈血，肝素抗凝，以無(wú)菌的PBS液等比釋稀，緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液上，兩者體積比約2：1，按Ficoll-gradient密度梯度離心法分離人P

11、BMC，2000r/min，離心20min，小心吸取白膜狀的單核細(xì)胞層，以無(wú)菌的PBS釋稀，離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌2次，細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱2h，而后用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗2次，將未貼壁細(xì)胞洗脫，貼壁的為單核細(xì)胞。將貼壁細(xì)胞用酶消化法消化下來(lái)，重懸于含有2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青、鏈霉素雙抗，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106備用。 2.3 P

12、BMC活性測(cè)定 各組在下一步實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。方法：制備單細(xì)胞懸液，稀釋為1×106個(gè)/ml，取l滴細(xì)胞懸液移入試管中，加一滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)液混勻。在3分鐘內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。根據(jù)下式求細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)） 2.4 實(shí)驗(yàn)分組： 以移液器將將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔2ml，共分4組，每組6個(gè)復(fù)孔，具體如下：

13、①空白組，不加任何干預(yù)，培養(yǎng)板細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)； ②LPS組：加入LPS使得其終濃度為10ng/ml，并加入PBS作為對(duì)照組； ③LPS+1 umol/l阿托伐他汀組：LPS終濃度為10ng/ml和阿托伐他汀終濃度1μmol/L； ④LPS+10μmol/l阿托伐他汀組：LPS終濃度為10ng/ml和阿托伐他汀終濃度10μmol/L。 2.5 TNF-α、IL-1β含量檢測(cè)： 分別收集各組單核細(xì)胞培

14、養(yǎng)液上清，Elisa法測(cè)量各分組上清液中TNF-α、IL-1β的含量，按免疫酶標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，大致如下：將不同濃度的TNF-α、IL-1β標(biāo)準(zhǔn)品、及待測(cè)品以每孔100μL加入酶標(biāo)孔，室溫下孵育120 min，然后洗板4次，加生物素標(biāo)記物，室溫下孵育60min，再洗板4次。加底物顯色劑避光室溫孵育30min，加終止液。在450nm波長(zhǎng)下讀取每孔吸光度值。以濃度值為橫坐標(biāo)，所測(cè)各吸光度均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。利用各樣本孔

15、測(cè)得的吸光度均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的濃度值。再乘以各自釋稀的倍數(shù)，就可得實(shí)際值。每個(gè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各濃度均做2個(gè)復(fù)孔。 2.6 數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果所測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)都納入分析，無(wú)缺失數(shù)據(jù)，因測(cè)量指標(biāo)的樣本較少n=6，總體分布未知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用中位數(shù)（median）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用了非參數(shù)檢驗(yàn)的方法，兩組間比較用兩個(gè)獨(dú)立樣本的willcoxon秩和檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本比較的用多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal

16、-wallis H檢驗(yàn)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算各組平均秩次及檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Z或卡方值（X2），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果： 1mmol/l阿托伐他汀分別均減少LPS刺激下PBMC分泌TNF-α53.3%、IL-1β35.4%，10mmol/l阿托伐他汀減少TNF-α82.0%、IL-1β65.6%，經(jīng)多個(gè)獨(dú)立樣的的Kruskal-wallis H檢驗(yàn)，分泌TNF-α的LPS+PBS組、LPS+1mm

17、ol/l托伐他汀組、LPS+10mmol/l阿托伐他汀組的平均秩次分別為：15.17、9.83、3.50，X2=14.363，P=0.001，分泌IL-1β的LPS+PBS組、LPS+1mmol/l托伐他汀組、LPS+10mmol/l阿托伐他汀組的平均秩次分別為：15.00、9.50、4.50，X2=12.737，P=0.002，可以認(rèn)為阿托伐他汀顯著下調(diào)脂多糖刺激下外周血單核細(xì)胞TNF-α、IL-1β的分泌量，且在一定范圍內(nèi)阿托伐他汀