雞PGCs生成過程中C1EIP基因調控機制的研究.pdf

1、生殖細胞可以把生物的遺傳信息傳遞給下一代，維持生命的傳遞，對生殖細胞分化研究具有重要意義。原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)是所有生殖細胞的始祖細胞，能夠在性腺中分化為精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)或卵原干細胞(Ovary stem cells，OSCs)，進而進一步發(fā)育分化為精子或卵子。PGCs的發(fā)生受到許多內源性調控因子和細胞外基質等外源因素的調控，這些因

2、子通過不同的信號通路，構成復雜的調控網(wǎng)絡，直接或間接地調控PGCs的形成。目前，研究者們通過體外分離培養(yǎng)、體外誘導、構建轉基因細胞等方多種方式對PGCs的生長和分化進行了大量的研究，然而關于調控PGCs發(fā)生過程的具體調控網(wǎng)絡分子機制卻知之甚少，因此PGCs發(fā)生過程機制的探究成為近年來備受關注的焦點。
　　隨著PGCs研究的深入，研究者們已經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)存在一些關鍵性的基因、信號通路、生長因子以及表觀遺傳修飾因素在此過程中起到重要的調控

3、作用，隨著這些因素對于PGCs發(fā)生起到了一定的促進作用，但是并沒有真正從意義上提供提高PGCs生成效率，進而無法滿足相關的科研需求，因此亟需對從新的領域對PGCs的生成機制進行創(chuàng)新性地探究，深入了解和認識PGCs的產生過程，從而獲取大量的PGCs。
　　為了進一步探究調控PGCs發(fā)生及分化的作用機制，從根本上解決PGCs生成效率低下的問題，本研究基于本實驗室前期對雞胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)、

4、PGCs和SSCs的RNA-Seq測序結果中篩選到PGCs特異表達的新基因LOC418414（Genbank登錄號:XM_416629.3）的基礎上，根據(jù)其表達位置命名為C1EIP，對其在雞ESCs向PGCs分化過程中從體內和體外兩個水平上進行系統(tǒng)的功能和機制驗證，深入了解家雞ESCs向PGCs分化過程的調控機制，為有效提高ESCs向PGCs誘導分化效率提供理論依據(jù)和參考，并且為雞ESCs向PGCs分化其他類似關鍵功能基因的功能及機制研

5、究提供理論基礎。
　　研究結果如下:
　　1.為了有效確定候選特異基因C1EIP在的生物功能以及其真核細胞中的定位，為后期功能及機制研究奠定基礎，對C1EIP進行生物信息學分析顯示，C1EIP主要與鳥類同源性較高，但同源蛋白為未知蛋白，未發(fā)現(xiàn)特異的結構域。我們結合NCBI數(shù)據(jù)庫提供的C1EIP編碼序列，利用RT-PCR擴增C1EIP編碼區(qū)，分別構建重組表達載體pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP。以pEGFP

6、-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP轉染DF1細胞，確定C1EIP的定位，并以RT-PCR和Western Blot檢測C1EIP在真核細胞中轉錄和翻譯的情況;同時以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP載體，肌肉注射小鼠后采血制備抗小鼠血清，以IFA和Western Blot檢測抗體效價。酶切及測序結果均顯示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP載體構建成功。pEGFP-C1EIP轉染DF1細胞后，C1EIP表達于

7、細胞質中，說明C1EIP定位于細胞質中，且能夠啟動轉錄和翻譯;以1μg∶1.5μg的比例將PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP產物注射小鼠肌肉制備抗小鼠血清，IFA檢測最佳效價為1∶25，并以此效價進行Westen Blot檢測顯示能夠識別到C1EIP蛋白。
　　2.為了探究C1EIP在雞PGCs生成過程中生物學功能探究，我們針對C1EIP編碼區(qū)設計3個shRNA靶位點和1個陰性對照位點，構建慢病毒干擾載體，并進行慢病毒包裹，以

8、qRT-PCR檢測慢病毒干擾載體的干擾效率。在體外，以慢病毒干擾載體和過表達載體分別轉染2代ESCs細胞，結合RA誘導劑誘導，觀察ESCs形態(tài)變化，并以qRT-PCR、細胞免疫化學和流式細胞分析檢測PGCs生成效率;在體內，以慢病毒RNA干擾載體侵染雞胚，摸索出最佳的侵染效率，侵染后的雞胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫組化以及流式細胞分析等方法檢測PGCs生成效率。結果顯示成功構建慢病毒干擾載體C1EIP-sh1、C1EIP-s

9、h2和C1EIP-sh3，干擾效率分別為80.39％、87.80％和38.36％。在體外，正常RA誘導在第2d出現(xiàn)小類胚體（Embryoid Body，EB），在第4d時類胚體增多、變大，第6d類胚體的邊緣開始出現(xiàn)裂口，并且伴隨有少量的細胞從類胚體內部釋放，第8d時類胚體嚴重破裂，大量細胞釋放，在第10-12d類胚體基本上裂解完全，出現(xiàn)類精原干細胞（Spermatogonial stem cells-like，SSCs-like），并聚

10、團成葡萄串狀克隆;過表達組中，在第2d出現(xiàn)大的類胚體，第4d類胚體邊緣開始出現(xiàn)小缺口，第6d類胚體大部分破裂并釋放大量內部細胞，第8d出現(xiàn)類SSCs細胞，第10-12d出現(xiàn)典型的呈葡萄串狀的SSCs克隆;在敲低中，第2-6d細胞未出現(xiàn)類胚體，第8d開始出現(xiàn)小的類胚體，然而培養(yǎng)至12d類胚體的數(shù)量、大小以及形態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化;qRT-PCR結果顯示過表達C1EIP后，全能性基因sox2表達量總體上由1.00±0.04持續(xù)降低至0.14

11、±0.01，而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表達量自始至終都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03和2.59±0.05，目的基因C1EIP表達量在第4d上升至3.99±0.06，在第12d時由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后，sox2表達量在第0-12d中沒有顯著的變化，cvh、c-kit和C1EIP表達量分別由1.00±0

12、.02、1.00±0.01和1.00±0.02穩(wěn)定持續(xù)下降至0.55±0.01、0.70±0.01和2.87±0.07，Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表達量由1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03和1.00±0.04分別先下降至0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03和0.76±0.02，然后再略微上升至0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0

13、.93±0.08;細胞免疫化學結果顯示相對于RA誘導組，過表達組顯著增加CVH和C-KIT的表達，而敲低組抑制CVH和C-KIT的表達。流式細胞分析結果顯示，RA誘導組中CVH+細胞比例為3.4％，在過表達C1EIP后，CVH+細胞比例顯著上調至4.6％，然而敲低C1EIP使得CVH+細胞降低至2.9％。在體內，雞胚注射慢病毒載體的最佳條件為鈍端注射10μL106TU/mL慢病毒干擾載體+90μL DMEM，注射后能夠穩(wěn)定表達egfp且

14、雞胚能夠激發(fā)綠色熒光。qRT-PCR結果顯示各個基因的表達量在Blank組和sh-Ctrl組之間沒有顯著的變化，而在敲低C1EIP后，全能性基因sox2的表達量下降趨勢相對于其他分組有所減緩，而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖相關基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0

15、.04和0.22±0.03; PAS結果顯示敲低C1EIP能夠顯著降低PGCs的產生。免疫組織化學結果顯示空白組和陰性對照組中生殖嵴中高度表達CVH和C-KIT，且表達部位幾乎充滿整個生殖嵴中，然而在敲低組中，CVH和C-KIT蛋白表達明顯降低，并且表達的部位僅僅局限于生殖嵴的邊緣部分。流式細胞分選結果顯示，相對于空白組和對照組（4.6％和4.3％），敲低C1EIP使得CVH標記的PGCs比例明顯下調至3.1％。
　　3.為了系統(tǒng)

16、有效地闡明C1EIP表達的轉錄水平調控機制，我們結合NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫中查詢C1EIP轉錄起始位點上游啟動子2000bp左右的序列，擴增C1EIP啟動子長片段，克隆至pEGFP-N1載體中，置換CMV啟動子，構建重組表達載體pC1 EIP-EGFP，轉染至DF1細胞中檢測C1EIP啟動子長片段的啟動活性;通過缺失片段克隆技術，構建C1EIP啟動子不同缺失片段載體PGL3-P1～PGL3-P10，轉染DF1細胞后以雙熒光素酶報告系統(tǒng)

17、檢測各個缺失片段的啟動子活性，篩查出C1EIP啟動子核心調控區(qū)域;在此區(qū)域以生物信息學預測關鍵轉錄因子結合位點，并對各個轉錄因子結合位點分別進行定點缺失，構建缺失載體，同樣以雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉錄因子結合位點缺失對啟動子活性的影響;最后分別10μmol/L、1μmol/L和4mmol/L的5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和valproic acid(VPA)處理，

18、檢測DNA甲基化和組蛋白乙?；瘜1EIP啟動子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表達變化的影響。酶切及測序結果均表明pC1EIP-EGFP構建正確，轉染DF1細胞后能夠激發(fā)綠色熒光，定性地說明擴增的C1EIP啟動子長片段具有啟動活性;同時啟動子各個缺失片段載體酶切和測序結果也表明載體構建成功，雙熒光素酶檢測啟動子活性結果顯示P4-P6間，即-1025～-912bp為C1EIP啟動子的核心活性區(qū)域;在此區(qū)域內關鍵的轉錄因

19、子結合位點包括MEIS1、MAFG∷NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1∷Tcf3，其中只有STAT3起到正向調控作用;最后發(fā)現(xiàn)在DNA甲基化抑制5-Azadc以及組蛋白乙?；种苿㏕SA和VPA處理后，C1EIP啟動子活性由10.82±0.54上升至18.49±0.72、33.27±0.83和38.11±0.53，同時5-Azadc、 TSA和VPA處理后，C1EIP在雞ESCs、PGCs和SSCs中表達量分別由1.00±0

20、.23、5.73±0.54、0.94±0.23變化為1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16以及2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。
　　4.為了探究C1EIP調控PGCs生成的機制，我們通過構建C1EIP原核表達載體，誘導其在大腸桿菌中表達，以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白，構建融合表達載體pcDNA3.0-

21、ENO1-HA，以體外免疫共沉淀技術驗證ENO-HA和C1EIP-EGFP間互作關系。結合在線數(shù)據(jù)庫，以生物信息學分析技術探究互作基因ENO1的關聯(lián)基因，以qRT-PCR驗證其在PGCs生成過程中的表達變化情況。通過構建Myc啟動子的雙熒光素酶報告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達載體pcDNA3.0-MBP-1，同時為了消除同源家族基因的干擾，我們還構建了ENO2的重組表達載體pcDNA3.0-ENO2，結合之前構建完成的pcD

22、NA3.0-ENO1-HA載體，共轉染DF1細胞，以雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測Myc啟動子活性變化情況，并根據(jù)所得結果和查找相關文獻，繪制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介導Notch信號通路調控PGCs生成的模式圖。GST pull-down結果顯示C1EIP與ENO1之間存在互作，且體外免疫共沉淀驗證C1EIP之與ENO1間的互作關系。通過Uniport和PSORTⅡ數(shù)據(jù)庫以及共表達網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)ENO1定位于細胞質中，與Myc相互

23、關聯(lián)，Myc下游基因為Notch1。qRT-PCR結果顯示C1EIP和ENO1在雞ESCs向SSCs分化過程中表達趨勢保持一致，并且與Myc和Notch1表達趨勢相反。酶切和測序結果顯示雙熒光素酶報告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達載體pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均構建成功，且雙熒光素酶檢測結果顯示MBP-1對Myc啟動子活性存在抑制作用，而ENO1和ENO2對其沒有影響。最后根據(jù)以上結果和相關文獻報