脂肪間充質(zhì)干細胞與肝細胞的相互作用及其聯(lián)合移植保護急性肝損傷的實驗研究.pdf

1、急性肝功能衰竭是臨床常見危重癥，一直以來無肯定有效的治療措施，病死率居高不下，維持在60％-80％。原位肝移植被認為是肝衰竭最佳的治療手段，但因供肝來源少、成本高、手術復雜、術后需長期免疫抑制治療促使人們尋找更適宜的方法。肝細胞移植作為器官移植的替代治療，已經(jīng)證實在治療肝衰竭及代謝缺乏性肝臟疾病方面顯示出良好的療效。但是異種或異體肝細胞移植后免疫排斥反應是肝細胞移植失敗的首要原因。其次肝細胞體外存活時間短，不能大量增殖及傳代。在這種情況

2、下，研究者致力于干細胞的移植治療以期望克服這些不足。
　　 近年來間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植已成為治療急性肝功能衰竭的新興治療手段。干細胞能自我復制且具有多向分化潛能，在適宜的條件下能分化成需要的細胞并具有相應功能。更重要的是，MSCs與胚胎干細胞比較，更符合倫理要求，具有免疫調(diào)節(jié)功能，體外能大量增殖且增殖速度快。在MSCs的眾多組織來源中，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(AMSCs)具有

3、來源豐富，免疫原性低等優(yōu)勢，有可能成為治療終末期肝病最佳的細胞來源，但治療的時效性、安全性和潛在的療效還需進一步證實。由于單獨的MSCs或肝細胞移植治療的局限性限制了下一步的研究，因此我們設想是否能采取聯(lián)合移植的方法，起到兩種細胞在細胞功能、免疫調(diào)節(jié)等方面相互協(xié)同作用，從而避免單獨移植的局限性。
　　 為此，本實驗首先分離人不同部位來源(包括眼袋、皮下)脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(human adipose derived me

4、senchymla stem clells，hAMSCs)和鼠肝細胞，將分離的MSCs行表面分子標志鑒定以及成骨成脂誘導，并對不同部位來源的hAMSCs行生物活性比較；其次體外在肝衰竭病人血清(hepatic failure serum HFS)刺激下，將兩種細胞以不同比例分別行間接或直接共培養(yǎng)，以及在無血清刺激下長期間接共培養(yǎng)，從細胞因子水平、基因表達、細胞功能等多方面探討兩種細胞的相互作用及可能的作用途徑；最后將脂肪間充質(zhì)干細胞(a

5、dipose derived mesenchymal stem cell，AMSCs)用菲立磁標記后，與肝細胞聯(lián)合移植急性肝損傷大鼠模型，證實聯(lián)合移植的有效性及優(yōu)越性。
　　 本實驗主要的研究結果如下：
　　 1、采用Ⅳ型膠原酶消化法獲得了大量、穩(wěn)定、快速分離不同部位組織(包括皮下、眼袋)hAMSCs的方法。流式細胞儀表面分子鑒定提示分離的細胞具有MSCs的表型特征，而不表達造血干細胞或上皮細胞的標志物。分離的細胞具有成

6、骨、成脂誘導分化潛能。比較了兩個不同部位(皮下、眼袋)來源的單位質(zhì)量脂肪組織間充質(zhì)干細胞獲得數(shù)量，細胞貼壁率，細胞曲線以及衰老相關性β-半乳糖苷酶染色，證實了單位質(zhì)量眼袋脂肪組織獲得的干細胞數(shù)量及細胞貼壁率高于皮下脂肪組織，但是在細胞衰老、細胞生長速率方面沒有差別。
　　 2、hAMSCs與鼠肝細胞分別以(1:5、1:10、1:20、1:50)四個不同比例直接混合培養(yǎng)，加入：HFS刺激72h與肝細胞單獨培養(yǎng)比較。結果表明混合培養(yǎng)

7、組能減輕HFS對肝細胞的毒性刺激，且最適宜的混合比例是1:10。證實了hAMSCs具有保護HFS對肝細胞毒性損傷的作用。
　　 hAMSCs與肝細胞以1:10比例間接混合培養(yǎng)，加入HFS72h，收集培養(yǎng)上清液測定細胞因子水平和肝功能，并對間接培養(yǎng)組上層間充質(zhì)干細胞行基因表達檢測。在測定細胞因子中，只有IL-6水平明顯增高。加入IL-6抗體后，細胞存活率、肝細胞分泌的白蛋白及尿素氮水平明顯下降。提示IL-6是對肝細胞具有保護作用的

8、重要細胞因子。RT-PCR和細胞功能檢測顯示共培養(yǎng)上層hAMSCs在血清刺激72h內(nèi)不表達肝細胞特異性基因，也不具有肝細胞的代謝功能。而hAMSCs和鼠肝細胞在無肝衰竭血清
　　 刺激下長期體外混合培養(yǎng)，從第7天開始間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞樣細胞，并具有肝細胞形態(tài)和功能。提示hAMSCs對肝細胞的保護作用在肝衰竭血清作用初期是通過免疫調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，而不是通過轉(zhuǎn)分化作用。
　　 3、用普魯士藍染色SPIO標記hAMSCs，可

9、見標記細胞胞質(zhì)內(nèi)含有多少不等的藍染鐵顆粒，且細胞活力、生長能力、增殖功能沒有受到影響，顯示SPIO成功標記hAMSCs。從尾靜脈、股靜脈、門靜脈三種途徑移植SPIO標記的hAMSCs治療CCl4誘導的急性肝損傷大鼠模型。移植7天后大鼠的一般情況好轉(zhuǎn)，肝功能、肝組織改善顯著，但是三種途徑間療效沒有明顯統(tǒng)計學差異。移植后血清細胞因子水平IL-6，IL-10，IFN-γ較對照組均有明顯增高，p<0.05，提示免疫調(diào)節(jié)作用可能是hAMSCs治療

10、急性肝損傷的機制之一。
　　 hAMSCs與肝細胞聯(lián)合移植與hAMSCs、肝細胞單獨移植做比較，hAMSCs與肝細胞聯(lián)合移植治療是可行的，并且在肝功能改善、肝臟組織修復方面優(yōu)于hAMSCs或肝細胞單獨移植。
　　 總之，本研究在成功分離hAMSCs的基礎上，對人兩個不同部位AMSCs的生物學特性進行了較深入的研究，從細胞因子水平、肝功能、基因表達等方面探討了hAMSCs和肝細胞間的相互作用。證實了hAMSCs具有保護肝細