大鼠骨髓來源樹突細胞的體外培養(yǎng)及功能測定.pdf

1、目的:樹突細胞(dendritic cell,DC)源于造血干細胞,廣泛分布淋巴組織和非淋巴組織,是機體內功能最強的抗原呈遞細胞(antigenpresenting cell,APS)。DC與其他抗原呈遞細胞相比其最大的特點是能顯著刺激初始型T細胞增殖。而其他抗原呈遞細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞,因此DC是機體免疫反應的始動者,在免疫反應應答中具有獨特的地位。目前認為具有典型的樹突狀形態(tài),膜表面高表達主要組織相容性復合體-Ⅱ(ma

2、ior histocompability complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)類分子,能移行至淋巴器官和刺激初始型T細胞增殖活化,并且具有一些相對特異的表面標志的一類細胞方能稱之為DC。所以要鑒定是否是DC往往通過形態(tài)學,組合型表面標志和刺激初始型T細胞增殖能力三個方面加以綜合判斷。本文系以8～10周齡近交系SD和Wistar大鼠為研究對象,應用大鼠骨髓來源DC的體外誘導與擴增,以光鏡、掃描電鏡觀察DC的形態(tài)學檢測細胞形態(tài)變化以及DC表型分

3、析來研究大鼠骨髓來源樹突細胞的體外培養(yǎng)及功能測定。
　　 方法:(1)選擇8～10周齡近交系SD和Wistar大鼠(體重180～200g)作為實驗對象。獲取大鼠骨髓來源DC,并分為實驗組和對照組,實驗組DC培養(yǎng)基中含有Rgm-CSF和Ril-4,對照組培養(yǎng)基中不含有Rgm-CSF和Ril-4,培養(yǎng)基其余成分及培養(yǎng)方法相同,進行體外誘導與擴增。培養(yǎng)期間隔日半量換液1次,并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況和形態(tài),分別培養(yǎng)13天后收

4、獲懸浮細胞。(2)觀察DC形態(tài)學:①光鏡觀察:培養(yǎng)期間每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。②掃描電鏡觀察(培養(yǎng)13天的實驗組DC用掃描電鏡進行觀察)。(3)流式細胞儀檢測細胞表面表型。用相同熒光素直接標記的同分異構抗體代替標記抗體作對照。(4)制備淋巴細胞懸液并進行細胞分離,將其分別與實驗組和對照組DC細胞按不同比例混合,孵育培養(yǎng)后測492nm吸光度(A)值。(5)所有數據以SPSS16.0軟件包進行處理,兩組間比較采用t檢驗,P＜0.0

5、5為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:①光鏡觀察:培養(yǎng)13天后,對照組大鼠骨髓細胞呈類圓形,分散生長。實驗組大部分細胞呈懸浮狀態(tài),細胞有明顯毛刺。②掃描電鏡觀察:培養(yǎng)13天后,實驗組的細胞表面有大量樹突狀突起,比較粗糙,某些突起形成薄片樣結構,符合典型的DC形態(tài)特征。③大鼠DC特異性表面分子OX-62的表達:其中對照組DC的OX-62表達量為40.79±1.49％,實驗組DC的OX-62表達量為41.44±1.92％,兩組差異無統(tǒng)計學

6、意義(P＞0.05)。④共刺激分子表達:對照組DC前體共刺激分子CD80、CD86陽性表達率分別為14.39±0.98％和17.38±1.11％,而實驗組DC共刺激分子CD80、CD86陽性表達率分別為85.06±2.98％和83.83±3.19％,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。⑤DC對同種T細胞的促增殖能力:MLR結果顯示對照組DC前體不能有效刺激同種T細胞增殖,而實驗組DC具有較強的體外刺激T淋巴細胞增殖的能力,隨著DC

7、數量的增加,T細胞的增殖效應加強,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。本實驗中,我們將貼壁時間縮短至3小時,改變了以往為去除粒細胞和淋巴細胞將大鼠骨髓細胞貼壁培養(yǎng)4-6天后懸浮細胞,培養(yǎng)的DC43％表達OX-62,與此前相關報道的數據不同。
　　 結論:本實驗結果表明,加入Rgm-CSF和Ril-4的培養(yǎng)基可以誘導骨髓前體細胞分化發(fā)育為成熟DC。成熟DC具有較強的體外刺激T淋巴細胞增殖的能力。實驗組的DC前體細胞經過13天的培養(yǎng),