慢病毒介導Smad7基因對角膜增殖與纖維化的抑制作用.pdf

1、[背景及目的]
　　準分子激光表層角膜切削術(surface ablation)包括準分子激光角膜切削術(photorefractive keratectomy,PRK)、準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(laser subepithelial keratomileusis,LASEK),微型角膜刀法準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(epipolis laser in situ keratomileusis,Epi-LASIK),較準分子

2、激光原位角膜磨鑲術(laser in situ keratomileusis,LASIK)而言,更為安全,并且減少了術后像差。所以,表層角膜切削術受到越來越多的關注。但是,表層角膜切削術也有其目前無法避免的不足,即術后角膜出現(xiàn)上皮下基質表層的混濁,排列紊亂的膠原沉積,臨床上稱為角膜上皮下混濁(haze)。Haze是表層角膜切削術最常見的術后并發(fā)癥,角膜透明度下降,可引起視力或視覺質量下降、屈光回退。既往研究表明haze的產(chǎn)生與角膜創(chuàng)面的

3、愈合過程和角膜細胞的反應直接相關。角膜創(chuàng)面的愈合過程是由多種細胞因子、生長因子和趨化因子介導的級聯(lián)反應。該級聯(lián)反應刺激角膜基質細胞發(fā)生凋亡,繼而誘發(fā)周圍基質細胞移行、活化、增殖,并向肌成纖維母細胞轉化,同時分泌大量細胞外基質,大量排列紊亂的膠原物質,以Ⅲ型膠原纖維為主,無規(guī)律沉積于角膜上皮下,即形成haze。所以抑制角膜基質細胞的移行、活化、增殖和轉化,減少膠原物質的產(chǎn)生是控制haze的關鍵。而在haze形成過程中的角膜基質細胞的增殖與

4、纖維化與TGFβ的關系最為密切,阻斷TGFβ的作用是減少角膜增殖與纖維化,抑制haze的關鍵。在TGFβ信號傳導過程中,Smad7作為TGFβ受體后下游的抑制型信號傳導因子,起著至關重要的作用。Smad7可以通過自分泌負反饋環(huán)來控制TGFβ信號的強度和持續(xù)時間。
　　為了探討Smad7基因治療是否能減少角膜愈合過程中基質細胞的增殖與纖維化,本研究選擇Smad7作為外源性目的基因,選用轉染效率高、免疫原性低、較為安全的第三代慢病毒作

5、為載體,構建Smad7慢病毒載體,將Smad7基因導入體外培養(yǎng)的大鼠角膜基質細胞和PRK動物模型角膜組織內,通過檢測TGFβ的激動型信號傳導因子的活化程度,角膜細胞的活化增殖和轉化指標,膠原的合成情況,研究Smad7基因對角膜增殖和纖維化的作用,為基因治療角膜haze,乃至其它角膜瘢痕,探索新的途徑。
　　[方法]
　　一、大鼠Smad7基因慢病毒載體的構建與鑒定
　　根據(jù)大鼠Smad7基因全序列,設計特異性引物,以大

6、鼠大腦皮層和腎臟總RNA為模板,通過逆轉錄PCR擴增獲得大鼠Smad7cDNA片段,克隆入pcDNA-copGFPLentivector質粒進行測序。將Smad7重組質粒轉導入293細胞中,觀察GFP的綠色熒光,并用real-timePCR和westernblot方法檢側Smad7在真核細胞中的表達。鑒定后包裝成smad7慢病毒重組載體Lv-Smad7。同法構建無Smad7外源基因的空質粒慢病毒載體Lv-plasmid作為對照病毒。

7、r>　　二、體外Smad7慢病毒對角膜基質細胞增殖與纖維化的抑制作用
　　培養(yǎng)大鼠角膜基質細胞,感染Lv-Smad7后檢側Smad7的表達,建立Smad7陽性細胞克隆。同樣方法建立空質粒陽性細胞克隆。進行分組:①正常細胞組:正?；|細胞,不加TGFβ2;②TGFβ2對照組:正常基質細胞加TGFβ2共孵育;③空質粒組:感染Lv-plasmid的陽性細胞,加HTGFβ2共孵育;④Smad7組:感染Lv-Smad7的陽性細胞,加TGFβ

8、2共孵育。TGFβ2的終濃度為10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Westernblot法檢測磷酸化Smad2蛋白(phosphorylated Smad2,p-Smad2)。TGFβ2刺激48h后Westernblot和real-timePCR法檢測α-SMA(α-smooth muscle actin)、Ki67mRNA和蛋白的表達,Ⅲ型膠原蛋白(Type Ⅲ collagen,ColⅢ)mRNA的表達。MTT法檢測基質細胞生長活

9、性。
　　三、體內Smad7慢病毒對角膜增殖與纖維化的抑制作用
　　SD大鼠96眼(右眼)隨機分為4組:①假手術組:刮除角膜上皮,不予以激光切削;②手術組:行PRK手術,即刮除角膜上皮,并予以激光切削:③空質粒組:行PRK手術,并予LV-plasmid滴眼;④Smad7組:行PRK手術,并予LV-Smad7滴眼。病毒液滴眼時間為手術當天及術后1w內每日1次,以后每周1次。于術后1d、1w、1m、3m采集角膜標本。Real-t

10、imePCR檢測角膜組織中Smad7、TGFβ2、α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的表達,Westernblot法檢測角膜組織中Smad7和P-Smad2的表達。
　　[結果]
　　一、大鼠Smad7基因慢病毒載體構建成功
　　通過PCR擴增獲得1.3kbSmad7cDNA片段,與載體連接成Smad7重組質粒。測序結果與GenBank序列一致。Smad7重組質粒和空質粒分別進行慢病毒包裝后獲得Lv-Smad7和L

11、v-plasmid,病毒滴度約為1.0×104ifu/μl。
　　二、體外Smad7慢病毒對角膜基質細胞增殖與纖維化的抑制作用
　　(一)Smad7基因在角膜基質細胞內的表達測定
　　Lv-Smad7體外感染角膜基質細胞后,檢測結果表明Smad7在轉錄和翻譯水平上的表達均明顯增強,證實Lv-Smad7成功感染基質細胞,并能在細胞內高效表達。
　　(二)p-smad2蛋白的Westernblot檢測結果
　　

12、Smad7組P-Smad2蛋白量較空質粒組下降,而TGFβ2對照組較正常細胞組增加。
　　(三)ColⅢα1鏈mRNA的real-timePCR檢測結果
　　結果顯示,TGFβ2可以促使正常角膜基質細胞合成colⅢ增加,TGFβ2對照組與正常細胞組比較P＜0.05;而導入Smad7后,colⅢα1鏈mRNA的表達受到抑制,Smad7組為空質粒組的38.3％,Smad7組與空質粒組比較P＜0.05。
　　(四)α-SMA

13、和Ki67mRNA和蛋白表達的檢測結果
　　TGFβ2可使角膜基質細胞內α-SMA和Ki67的mRNA和蛋白的合成均增多(P均＜0.05),而導入Smad7后,α-SMA和Ki67的合成均受到抑制,Smad7組與空質粒組比較,差異有顯著性意義(P均＜0.05)。
　　(五)MTT法檢測細胞生長活性結果
　　TGFβ2促進角膜基質細胞增殖:而Smad7可阻斷這種作用,使細胞生長活性減弱,Smad7組與空質粒組比較,差異有

14、顯著性意義(P均＜0.05)
　　三、體內Smad7慢病毒對角膜增殖與纖維化的抑制作用
　　(一)Smad7mRNA和蛋白在角膜組織中的表達
　　real-timePCR和WesternBlot結果顯示各時間點Smad7mRNA及蛋白表達量Smad7組較空質粒組增高(P均＜0.05),1m達高峰,3m時仍持續(xù)高表達。
　　(二)角膜組織中p-Smad2蛋白的Westernblot檢測結果
　　術后1d起手術

15、組p-Smad2的表達即開始增高,并持續(xù)至3m,與假手術組比較差異有顯著意義(P均＜0.05)。而Smad7組與空質粒組比較,在1w、1m、3m時pSmad2蛋白的表達量均下降,差異存在顯著性意義(P均＜0.05)。
　　(三)TGFβ2、α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的檢測結果
　?、傩g后1w、1m、3m時TGFβ2mRNA的表達手術組較假手術組增高,差異存在顯著性意義(P均＜0.05);而Smad7可減少TGFβ

16、2合成,同時間點Smad7組較空載質粒組TGFβ2明顯減少(P均＜0.05)。
　?、谛g后1w起α-SMAmRNA的表達開始增高,1m為高峰,持續(xù)至3m仍有較高表達(P手術組vs假手術組均＜0.05);而Smad7組與空質粒組比較,在1w、1m、3m時α-SMAmRNA的表達均下降,分別為空質粒組的82.7％、67.6％和59.5％(P均＜0.05)。
　　③術后1d起手術組Ki67mRNA的表達即增高(P組2vs組1＜0.

17、05),1w及1m為高峰,3m時Ki67的表達量較1m時下降(P3mvs1m＜0.05)。Smad7組1w、1m、3m時Ki67mRNA的表達均較空載質粒組減少(P均＜0.05)
　?、躢olⅢmRNA的表達術后1w起手術組開始增高,1m為高峰,持續(xù)至3m仍有較高表達,與假手術組比較差異有顯著意義(P均＜0.05)。而同時間點Smad7組與空質粒組比較,在1w、1m、3m時colⅢmRNA的表達量均下降(P均＜0.05)。

18、　　[結論]
　　一、Smad7慢病毒重組載體構建可行,在大鼠角膜體內外可高效表達。
　　二、體外研究表明Smad7基因導入大鼠角膜基質細胞可阻斷TGFβ信號傳導通路,減少smad2的磷酸化,阻止基質細胞的活化增殖,阻斷基質細胞向肌纖維母細胞的轉化,并且減少膠原蛋白Ⅲ的合成,從而抑制角膜基質細胞增殖和纖維化。
　　三、體內研究表明Smad7基因治療可降低大鼠角膜內TGFβ2mRNA的表達,減少smad2的磷酸化,阻止角