大腸桿菌不耐熱腸毒素亞單位的克隆、表達(dá)及A亞單位單克隆抗體的制備.pdf

1、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin,LT)是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)產(chǎn)生的六聚體蛋白。不耐熱腸毒素除了較強(qiáng)的毒性外，還具有很強(qiáng)的免疫原性以及能夠輔助其他抗原通過(guò)粘膜免疫途徑使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，因而它還是良好的粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中具有重要價(jià)值。 本研究以產(chǎn)不耐熱腸毒素44814株為材料，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基CAYE-2培養(yǎng)后，收集的菌

2、液經(jīng)多粘菌素B和超聲波處理，獲得腸毒素粗提物。通過(guò)硫酸銨沉淀后，D-Salt Dextran Desalting Column層析脫鹽獲得腸毒素的初步提取物。提取物過(guò)濾除菌后，通過(guò)健康家兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)和CHO細(xì)胞毒性試驗(yàn)，證明了所獲得腸毒素的初步提取物能引起家兔回腸腸液蓄積和CHO細(xì)胞形變、死亡，符合不耐熱腸毒素的生物學(xué)特性，表明提取物中含有不耐熱腸毒素，從而為后續(xù)研究提供了檢測(cè)抗原。 為了進(jìn)一步了解不耐熱腸毒素的生物學(xué)特性，根

3、據(jù)其已發(fā)表的A、B亞單位結(jié)構(gòu)基因序列，各設(shè)計(jì)一對(duì)引物，經(jīng)PCR從產(chǎn)腸毒素大腸桿菌44814株分別擴(kuò)增出LT-A、IX-B結(jié)構(gòu)蛋白基因片段，并分別定向克隆入pGEX-6P-1質(zhì)粒載體，分別獲得重組質(zhì)粒pGEX-LXA和pGEX-LTB。重組菌裂解物的SDS-PAGE及Western-blot分析證明，含有重組質(zhì)粒pGEX-LTA的大腸桿菌BL21能夠表達(dá)分子量約為56ku的融合蛋白GST-LTA，含有重組質(zhì)粒pGEX-LTB的大腸桿菌BL

4、21能夠表達(dá)分子量約為39ku的融合蛋白GST-LXB，從而為研制LT的單克隆抗體提供了抗原。 單克隆抗體作為一種良好的檢測(cè)試劑，具有較強(qiáng)的特異性。本研究利用初步提純A亞單位的表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原免疫6周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用間接ELISA檢測(cè)，經(jīng)三次亞克隆得到了穩(wěn)定分泌抗LTA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株F8和G9，制備了腹水，并利用該單抗初步建立了間接ELISA和Dot-ELISA等特異性檢測(cè)