遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin與PAM14蛋白的相互作用.pdf

1、遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良?。⊿pondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT，MIM 313400）是一種X連鎖隱性遺傳病，主要累及脊椎椎體和承重大關(guān)節(jié)。其主要臨床特征為：患者骨骼病變，?；脊顷P(guān)節(jié)炎，身高增長下降致短軀干性侏儒。
　　 SEDL基因的突變導(dǎo)致SEDT的發(fā)生（MIM 300202）。該基因定位于Xp22，全長20 kb，包含6個外顯子。SEDL基因的表達(dá)產(chǎn)物為140個氨基酸組成的Sedl

2、in蛋白，而且該蛋白高度保守，在人類和酵母具有相同的氨基酸序列。Sedlin蛋白是酵母TRAPP（transport protein particle）復(fù)合物中Trs20p亞基的同源物。目前認(rèn)為TRAPPⅠ定位于高爾基復(fù)合體的順面，為COPⅡ膜泡的受體，在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體的膜泡運輸中發(fā)揮作用；TRAPPⅡ則主要作用于高爾基復(fù)合體內(nèi)部的物質(zhì)運輸。酵母中Trs20p亞基是 TRAPPⅠ、TRAPPⅡ所共有的，而且Trs20p亞基的失活

3、具有致死效應(yīng)，因此推測Sedlin蛋白質(zhì)可能在物質(zhì)運輸過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基復(fù)合體之間的膜泡運輸中發(fā)揮作用。
　　 為了了解哺乳動物細(xì)胞中Sedlin蛋白的功能，本課題組成員已經(jīng)利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了若干Sedlin蛋白的結(jié)合蛋白，其中包括一些已知蛋白，如胞內(nèi)氯離子通道蛋白（chloride intracellular channel，CLIC），EB病毒誘導(dǎo)的基因3（Epstein-Barr virus-induced ge

4、ne 3，EBI3）蛋白，MRG相關(guān)的蛋白PAM14（protein associated with MRG，14 kD），它們在細(xì)胞內(nèi)均具有廣泛的功能。
　　 先前已利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段證實了在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)Sedlin蛋白與CLIC1是相互作用的，提示Sedlin蛋白可能在細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究是在上述研究的基礎(chǔ)上，探尋Sedlin蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)與PAM14蛋白是否存在相互作用，以進(jìn)一

5、步了解Sedlin蛋白的功能。首先構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCDGFP-SEDL、pCDGFP-PAM14，轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，通過免疫熒光方法，檢測Sedlin蛋白、PAM14蛋白單獨表達(dá)時在細(xì)胞內(nèi)的定位情況；轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot鑒定蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-3X-SEDL以表達(dá)融合蛋白GST-Sedlin，進(jìn)行GST-pull down 實驗，檢測Sedlin蛋白在體外

6、與PAM14蛋白能否相互作用；進(jìn)行免疫共沉淀和免疫熒光實驗，檢測在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)Sedlin蛋白與PAM14蛋白能否相互作用，能否共定位，共轉(zhuǎn)染對蛋白質(zhì)的定位有無影響。
　　 實驗結(jié)果表明，Sedlin蛋白為一分子量約16kD的蛋白質(zhì)，在胞質(zhì)和胞核中均有分布，且主要表達(dá)于胞核；GFP-PAM14融合蛋白的分子量約為41kD，主要表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)較少。GST-pull down 實驗結(jié)果表明，融合蛋白GST-Sedlin與PA

7、M14蛋白之間存在相互作用；免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用；免疫熒光實驗表明Sedlin蛋白與PAM14蛋白在細(xì)胞核存在共定位，且改變不同的蛋白標(biāo)簽，對共定位結(jié)果沒有影響。綜上，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用。
　　 PAM14，是由127個氨基酸殘基組成的14 kD的高度保守的蛋白質(zhì)。因其與MRG15（mortality facto