小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的動力學分析與優(yōu)化.pdf

1、小球藻(Chlorella)是一種單細胞微藻,含有豐富的蛋白質、類胡蘿卜素、多糖、維生素和小球藻生長因子等多種營養(yǎng)及活性成份,具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力和預防心血管疾病等生理功能.由于富含葉黃素(lutein),小球藻作為一種極具潛力的葉黃素源而受到關注.與其它葉黃素源相比,小球藻具有生長迅速、可進行異養(yǎng)培養(yǎng)等優(yōu)勢.但迄今為止,小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)效率和水平與其它微生物(如酵母等)培養(yǎng)體系相比還有很大的差距.為建立高效的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)系

2、統(tǒng)及葉黃素生產(chǎn)方式,本論文進行了以下方面的研究工作: (1) 通過搖瓶實驗對影響小球藻異養(yǎng)生長和葉黃素合成的主要培養(yǎng)參數(shù),包括接種量、通氣量及培養(yǎng)基中四種主要成分--葡萄糖、KNO<,3>、KH<,2和MgSO<,4>的濃度進行了研究和優(yōu)化,并在均勻設計實驗的基礎上建立了多元回歸模型.研究結果表明,充足的通氣量是小球藻生長和葉黃素合成的必要條件;葡萄糖濃度和c∶N比是影響小球藻異養(yǎng)生長和葉黃素合成的主要因素,在10

3、-0g/l范圍內(nèi),較高的葡萄糖起始濃度可提高小球藻的最終生物量和葉黃素產(chǎn)量,但抑制小球藻的生長速度;在2∶1-12∶1范圍內(nèi),較低的C∶N比有利于提高小球藻細胞中葉黃素含量. (2) 在對小球藻異養(yǎng)生長進行動力學分析的基礎上,通過流加方式的優(yōu)化實現(xiàn)了小球藻的高密度培養(yǎng).首先基于在 19-1 發(fā)酵罐中進行的分批培養(yǎng)實驗,構建了描述小球藻異養(yǎng)生長的確定化模型 (deterministicmodel),在該模型的基礎上通過采用遺傳算法

4、進行了流加方式的初步優(yōu)化,使小球藻的細胞濃度(以單位體積干重計)和最大生產(chǎn)效率分別達到104.9g/l和0.613 g/l/h.在進行多批流加培養(yǎng)實驗的基礎上,構建了推廣性能更好的混合神經(jīng)網(wǎng)絡模型,并對流加方式進行了再次優(yōu)化,使小球藻的細胞濃度和最大生產(chǎn)效率分別達到116.2g/l和1.020g/l/h,分別為分批培養(yǎng)中的5.8倍和4倍,高于目前已報道的最高水平. (3)通過對前期建立的動力學模型的比較分析,結合新獲得的研究結果

5、,構建了小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的動力學模型.該模型能夠較好地描述不同條件下分批和流加培養(yǎng)中的實驗結果,具有良好的通用性能.基于該模型的分析結果表明:培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度在5-24g/l之間,硝酸鉀濃度在0.7-12g/l之間有利于小球藻的葉黃素合成.通過對流加培養(yǎng)的優(yōu)化,葉黃素的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率分別達到249.4 mg/l和1.65 mg/1/h,為分批培養(yǎng)中的5.9和4.2倍,高于目前己報道的最高水平. (4)根據(jù)有關文獻報道和本

6、實驗室的測定結果,初步構建了小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的代謝網(wǎng)絡.通過代謝流分析(metabolic nuX analysis,MFA)發(fā)現(xiàn),在關鍵代謝節(jié)點乙酰輔酶A處,絕大部分代謝流量進入了與細胞生長密切相關的三羧酸循環(huán)和結構大分子物質的合成途徑,乙酰輔酶A節(jié)點的剛性可能是造成小球藻細胞中葉黃素含量難以提高的主要原因.極端代謝流分析的結果表明,葉黃素對葡萄糖的最高理論得率遠高于目前的實際得率,顯示在小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的得率方面還有很大的優(yōu)

7、化提高空間.根據(jù)關于類胡蘿卜素合成代謝的文獻報道和本研究的相關實驗結果,構建了小球藻中類胡蘿卜素合成代謝的生化系統(tǒng)理論(biochemieal system theorem,BST)模型,在此基礎上分析了培養(yǎng)過程中小球藻比生長速率對細胞中幾種類胡蘿卜素之間比例和葉黃素含量的影響,并通過模擬計算探討了提高細胞葉黃素含量的可能優(yōu)化方式.模擬結果顯示,催化乙酰輔酶A轉化為番茄紅素的代謝途徑中相關酶的活力較低,可能是限制小球藻細胞中葉黃素含量提

8、高的瓶頸. (5)對發(fā)酵罐中異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻細胞的流變學特性的研究結果顯示,在小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的表觀黏度值較低且變化不明顯,提示培養(yǎng)過程中沒有或極少有增加培養(yǎng)液黏度的物質分泌.對濃縮的小球藻懸浮液的流變學研究表明,當小球藻細胞濃度低于150g/1時,小球藻懸浮液呈現(xiàn)牛頓流體特性,黏度較低(<40 mPa·s),且隨著細胞濃度的提高緩慢增加;當小球藻細胞濃度繼續(xù)提高時,小球藻懸浮液轉變?yōu)榉桥ｎD流體特性,且黏度隨著細胞濃度

9、的增加而急劇上升.從流變學的角度考慮,小球藻是一種適合于高密度培養(yǎng)的微藻,在150g/l細胞濃度以下其流變學特性不會成為高效培養(yǎng)體系的障礙. (6)對于采用超臨界CO<,2>流體萃取小球藻中葉黃素的可行性進行了初步探討,對萃取壓力、萃取溫度、萃取時間以及攜帶劑等重要操作參數(shù)進行了優(yōu)化研究.當采取萃取壓力25 MPa,萃取溫度50℃,添加50﹪的乙醇作為攜帶劑,萃取4h時,葉黃素的提取效率達到87﹪.萃取物的HPLC分析結果顯示,